[发明专利]一种基于H1NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及原发性胆汁肝硬化。具体提供了一种基于H¹NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法。

背景技术

原发性胆汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis，PBC)是一类由自身免疫机制介导的、以肝内小胆管进行性、非化脓性炎症为特征的慢性胆汁淤积性疾病。最近在北美人群中展开的调查显示：PBC在普通人群中的年发病率(annualincidence)为30.3/1000000，其中男性和女性的年发病率分别为10.4/1000000和48.4/1000000，且近年来其患病率(prevalence)有逐年增长的趋势。PBC发病的原因在于环境和遗传因素的联合作用导致机体发生针对肝脏的自身免疫性反应，其中最主要的抗原就是位于线粒体内膜的丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(E2subunit of the pyruvate dehydrogenase enzyme complex，PDC-E2)。由于肝脏长期的自身免疫性反应而导致胆汁淤积和肝硬化，甚至肝功能衰竭。虽然熊脱氧胆酸(UDCA)在一定程度上可以延缓疾病的进展，肝移植也可以挽救部分晚期PBC患者的生命，但是调查显示，自诊断成立开始，PBC的五年生存率只有80％左右，低于健康对照组的存活率。在过去的几十年来，虽然人们探索PBC发病机制的努力从未中断，但对于PBC发病的具体分子机制仍然有诸多未解之谜。

代谢组学的定义是定量分析机体的某一器官、组织或者细胞在特定的时间和环境中所有低分子量代谢物浓度的一种科学。近年来，由于核磁共振、高效液相色谱仪/质谱、气相色谱/质谱等各种高通量技术的飞速发展，代谢组学被广泛地应用于疾病发病机制的研究中。参与外周血物质代谢是肝脏的重要生理功能之一，因此肝脏疾病可能会影响外周血或者尿液中的代谢物的变化，比如，有学者通过气相色谱/质谱(gas chromatography/mass spectrometry)发现肝癌患者尿液中有103种代谢物与健康个体不同，这些物质都是潜在的肝癌标志物，还有学者通过核磁共振法也发现肝癌患者外周血的代谢物谱存在明显异常。

本发明提供了一种基于H¹NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法。为研究PBC的诊疗提供了一些新的标志物，同时也为其发病机制的研究提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于H¹NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法。本发明是这样实现的，主要包括如下流程：

步骤1，样本收集与制备，肝功能测试；

步骤2，对原始数据进行提取、对齐与归一化；

步骤3，主成分(PCA)分析；

步骤4，正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)；

步骤5，引起组间差异的代谢物的寻找；

步骤6，统计检验。

本发明的优点在于：本发明提供的分析方法为原发性胆汁肝硬化代谢物的分析研究提供了一种新途径和方法，本方法设计合理可行，为研究PBC的诊疗提供了一些新的标志物，同时也为其发病机制的研究提供了新的思路。

附图说明

图1一种基于H¹NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法流程

具体实施方式

本发明所述，一种基于H¹NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法，本发明将以原发性胆汁性肝硬化患者外周血的代谢组学分析为例，说明本方法得具体实施步骤：

步骤1，样本收集与制备，肝功能测试；

所有PBC患者均为首诊患者，在血液标本采集前未接受任何医学处理，未合并各种病毒性肝炎。肝硬化的诊断标准是基于肝脏活解、影像学表现、实验室检查结果、临床表现以及HBV感染病史。静脉抽取空腹血液5ml，室温下放置30min以便血液凝固，900gr/min离心10min后收集血清置于-80℃保存。肝功能的测试，包括谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，白蛋白，γ-谷氨酰基转移酶(GGT)，总胆红素均在罗氏P800自动生化分析仪生化仪上完成。凝血酶原时间(PT)的检测在Thrombdyzer BERR型凝血仪上完成(ISI＝1.10)。

步骤2，H¹NMR技术检测，对原始数据进行提取、对齐与归一化；