[发明专利]磷氮霉素的生物合成基因簇

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗真菌、抗肿瘤抗生素磷氮霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

技术背景：

磷氮霉素(phoslactomycins)，其结构如图1所示，是上世纪80年代中期由我国沈寅初院士及其他日本学者从链霉菌Streptomyces RK-803发酵液中分离得到的一种聚酮类抗生素，其对多种植物病原菌具有显著抗菌活性。后来在其它链霉菌如S.platensis SAM-0654、S.SPRI-82715和S.platensis SANK 6091中陆续发现了同属于磷氮霉素家族的一系列化合物，各发酵组分的结构与来源与Streptomyces RK-803的磷氮霉素基本一致[J Antibiot(1989)42，1019-1025；J Antibiot(1989)42，1026-1036]。

1985年首先报道了磷氮霉素类化合物具有抗植物真菌的活性，其中磷氮霉素A-D表现出相同的抗真菌活性。通过制备型HPLC纯化得到的磷氮霉素A可以引起真菌菌丝体涨水，从而导致菌体生长受到抑制。通过传统琼脂稀释平板法发现纯化的phosphazomycin C具有很强的抗真菌活性。此后发现的其它磷氮霉素家族抗生素，仅在C-18取代基团有差别，也具有相同的抗真菌谱，这也进一步说明此处取代基的差异并不影响其生物学活性[J Antibiot(1985)38，665-668；J Antibiot(1989)42，1331-1338]。除了抗真菌活性，另有报道磷氮霉素还具有抗肿瘤活性，其作用机理也已研究得比较清楚。体外研究表明磷氮霉素是蛋白磷酸化酶2A(PP2A)的高效选择性抑制剂，IC50值变化范围从3.7到5.8μM(磷氮霉素为PP1的弱抑制剂，IC50＞1mM)，这一活性构成了磷氮霉素类化合物的其它生物学活性的基础，如NK细胞的先天及获得性免疫力对于肿瘤发展都具有重要作用，选择性增强NK细胞活性可以抑制肿瘤转移，在小鼠体内磷氮霉素A和磷氮霉素H能增强NK细胞活性，抑制肺转移，这一现象支持了此类化合物在NK细胞里具有抑制PP2A的功能[J Biochem(1999)125，960-965；Curr Med Chem(2002)9，2005-2032；JAm Chem Soc(2003)125，15694-15695]。近年来Teruya et al.利用化学遗传学方法描述了PP2A的催化亚基和其抑制剂磷氮霉素A之间的直接作用[FEBS Lett(2005)579，2463-2468]。

鉴于磷氮霉素良好的生物活性，已有通过化学全合成方法获得磷氮霉素及其类似物的研究。D.L.Boger等于2001年通过49步反应完成了对Fostriecin的化学全合成，其产率不足3％[J Am Chem Soc(2001)123，4161-4167]。2003年Tohru Fukuyama课题组通过48步反应完成了对Leustroducsin B的化学全合成[J Am Chem Soc(2003)125，4048-4049]。2006年Yuichi Kobayashi等完成了对Phoslactomycin B的化学全合成[Angew Chem Int Ed(2006)45，3320-3323]，总产率为0.61％，2008年Susumi Hatakeyama等以26步反应，总成率1.3％再次完成了Phoslactomycin B的化学全合成[Org Lett(2008)10，2139-2142]。全合成方法得到的大量结构类似物可以用于构效关系的研究等，对药物发展具有重要意义。然而由于这些合成路线非常复杂，产率不高，因此还不能真正应用到药物生产中。而通过基因工程改造，利用微生物发酵的方法在提高磷氮霉素的产量以及获得新的类似物方面都具有优势。据研究，天然的磷氮霉素的生物合成主要包括以下步骤：起始单元环己甲酰辅酶A的合成，特殊延伸单元乙基丙二酸单酰辅酶A的合成，I型线性聚酮合成酶(PKS)负责催化的大环骨架的合成，然后经过一系列的后修饰酶的作用形成磷氮霉素[J Biol Chem(2003)278，35552-35557]。