[发明专利]一种HPV多肽/DC混合疫苗及其制备

说明书

技术领域

本发明属于医学生物工程技术领域，具体地说涉及Toll样受体(TLR)的激动剂，作为一种HPV11E7表位肽特异性DC疫苗的佐剂，以期用于尖锐湿疣和宫颈癌的防治。

背景技术

人类乳头瘤病毒(HPV)可引起我国目前高发的性传播性疾病--尖锐湿疣以及HPV高相关性宫颈癌。尖锐湿疣的病原体主要为HPV6和11型，复发率高，顽固难治；而宫颈癌至今疗效和预后不佳，且逐年出现年轻化趋势，两者均成为严重危害患者、家庭、乃至社会的重大隐患。

尽管宫颈癌预防性疫苗已在多个国家上市，并显示了较理想的疗效。然而，目前多数HPV治疗性疫苗对人类机体细胞免疫的诱导激活较有限，临床试验也并未达到预期结果。由于HPV感染患者机体免疫力往往比较低下，不足以激发有效的细胞免疫清除病毒感染，而临床上又缺乏高效、特异性的抗HPV药物，因此，如何增强HPV蛋白的免疫原性、促进抗原的呈递以及寻找高效的佐剂等来提高机体的特异性抗病毒免疫是HPV疫苗研究中需迫切解决的关键问题。

Toll样受体(TLR)是存在于树突状细胞(DC)等抗原提呈细胞上的病原相关模式识别受体。当病原体感染机体时，TLR识别相应的配体而活化，通过不同的细胞内信号转导通路进而调节基因表达，从而在机体抗感染的天然免疫应答过程中发挥至关重要的作用。参与机体抗病毒免疫的主要有四种TLRs：以polyI:C(PIC)为激动剂的TLR3；以咪喹莫特等为激动剂的TLR7/8；以CpG为激动剂的TLR9。近来发现某些TLR激动剂可明显上调病毒抗原肽引起DC分化及功能成熟，从而引发更强的抗原特异性细胞免疫应答，因此认为TLRs在激发机体特异性抗病毒免疫、清除病毒感染的过程中也可能起着关键作用。而其激动剂也可能作为重要的免疫佐剂来上调各种预防性或治疗性疫苗的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HPV多肽/DC混合疫苗，所述的混合疫苗，主要由一份HPV11E7_7-15，一份体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DC)，一份CpG(TLR9激动剂)作为佐剂组成。

本发明的另一个目的是提供一种HPV多肽/DC混合疫苗的制备方法，通过以下技术方案实现：

(1)从小鼠骨髓提取树突状细胞(BM-DC)，进一步体外培养；

(2)先与免疫原性最强的一段HPV11E7CTL表位肽(HPV11E7_7-15，TLKDIVLDL)共孵育；

(3)再分别与TLR配体CpG等共孵育，以促进DC成熟；

(4)检测孵育后DC表面标志改变以确认其成熟度；

(5)上述刺激成熟的DC疫苗可用于免疫小鼠。

本发明将TLR配体与HPV11E7多肽联合使用可促进DC的成熟度，尤其联用CpG后可提高T细胞分泌细胞因子TNF-α和IFN-γ的水平。因此认为TLR9激动剂CpG对HPV11E7CTL表位肽在小鼠模型中的免疫应答具有一定程度的上调作用，可作为免疫佐剂以提高HPV11E7表位肽特异性的DC疫苗的免疫效应。本发明针对现有疫苗的不足，用TLR激动剂(CpG)作为免疫佐剂，以提高HPV11E7表位肽特异性的DC疫苗的免疫效应，用于尖锐湿疣和宫颈癌的防治。

附图说明

图1为BM-DC在TLR激动剂刺激下分化成熟。

图2为BM-DC经TLR激动剂刺激后在体内增强T细胞HPV11E7特异性细胞因子分泌。

图3为BM-DC经TLR激动剂刺激后在体外增强T细胞HPV11E7特异性细胞因子分泌。

图1-3中的每一个数据表示至少三个重复实验的平均值。

图中肽指HPV11E7CTL表位肽组。其中TNF-α指肿瘤坏死因子α，IFN-γ指γ干扰素。

^△表示和对照组相比有显著性统计学差异(P＜0.05)。

^▲表示和多肽组相比有显著性统计学差异(P＜0.05)。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1  小鼠骨髓来源的HPV11E7多肽/DC混合疫苗的制备

1)方法：