[发明专利]一株桉树内生菌及其在缓解铝毒害中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株桉树内生菌及其用途，更具体地涉及一株桉树内生菌及其在缓解铝毒害中的应用。

背景技术

铝是地壳中含量最丰富的金属(约占7％)，是继氧(O)和硅(Si)之后的第三大元素。近年来由于酸雨污染的加剧，许多作物发生了铝毒害。我国酸雨覆盖面积已经超过国土面积的30％，土壤中的铝被逐渐的释放出来，严重危害了林木和作物的产量和质量^[1-2]。

自从上世纪二十年代Hartwell和Pember首次发现Al毒害以来，对铝毒害的研究已经有九十多年了，但至今铝毒机制尚不是很清除，其主要原因是铝具有很复杂的化学性质。铝一般形成各种无机或有机物，其化学性质随着土壤PH的变化而发生改变。当土壤溶液的PH接近中性(PH＝7)时，铝主要以Al(OH)₃沉淀的形式存在；在碱性土壤中，铝主要以铝盐或Al(OH)₄^－的形式存在，这些物质对植物生长没有多少影响；在酸性土壤中，铝主要以Al(OH)^2＋、Al(OH)₂^＋、Al(H₂O)₆³⁺和Al³⁺离子形式存在，而铝离子会对植物产生明显毒害。因此，在铝毒机制的研究中，主要研究Al³⁺对植物的毒害^[3]。

菌根真菌吸收土壤中的养分和水分供植物生长需要，植物为寄生真菌提供真菌必要的碳水化合物和其它营养物质，它们相互依存共同生存。外生菌根菌主要寄生在植物的根表面形成一个紧密交错的菌套，在根皮层细胞间形成纵横交错的网络，但它们一般不进入到细胞内部。绝大多数乔灌木为外生菌根植物。土壤在酸性条件下溶出的大量铝对菌根有一定程度的伤害，但同时外生菌根对铝毒害也存在一定程度的缓解作用^[4-7]。证实能缓解铝毒害的内生菌方面尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株桉树内生菌及其在缓解铝毒害中的应用。

本发明所述桉树内生菌为青霉（Penicillium sp.）菌株2，所述菌株2的保藏号为CGMCC No. 4278。

该菌株2的分离、纯化包括：

A、材料：采集野外邓恩桉和尾巨桉植株直径0.5cm以下的根、直径0.5cm以下的茎段和成熟叶；

B、消毒：叶片消毒采用70％酒精浸泡40s、0.1％升汞浸泡90s，茎段消毒采用70％酒精浸泡30s、0.1％升汞浸泡60s，根部消毒采用70％酒精浸泡50s、0.1％升汞浸泡120s；

C、分离：将经严格表面消毒的野外邓恩桉、尾巨桉植株的根、茎段和成熟叶接入真菌固体培养基进行内生真菌的繁殖；

真菌固体培养基：为改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；

D、将分离繁殖出的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后，从中选择得到单一菌种，通过桉树接种试验，进一步验证其具有缓解铝毒害的作用后，鉴定并保存菌种；

点接种纯化：将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生真菌的接种效率与检出率。

本发明所述的桉树内生菌的制种方法即内生菌液的制备方法，是将上述的菌株2接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×10⁶cfu/ml即为成品备用；所述液体培养基：为改良马丁培养基,其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

本发明所述的桉树内生菌的用途，是将所述桉树内生菌接种桉树，用于缓解铝毒害；具体操作是应用该菌株的菌液，用于林地浇根、组培进入炼苗期前蘸根或组培过程的切芽阶段转入生根培养基前芽蘸。

所述林地浇根是采用5.0×10⁶cfu/ml菌液，按每株100ml在林地浇于每株桉树的根际。