[发明专利]一株桉树内生菌及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一株桉树内生菌及其用途。

背景技术

土壤缺磷已经成为制约世界农业发展首要因素，在世界13.19亿hm²耕地中缺磷的占据43％。我国农田的2/3土壤严重缺磷，其中南方土壤是磷含量最低的土壤之一。若单独依靠土壤中的磷，只能满足一季作物需要的1％～0.5％。在大部分土壤中，磷元素在土壤中的扩散能力差，一般集中在土壤表层，随着深度增加而降低。严小龙等研究表明，目前磷肥的利用率只有0%～25%，这意味着75％～90％的磷被转化为难吸收的磷酸盐，土壤已经形成了一个巨大的磷库。因此，磷高效利用成为当今解决土壤磷缺乏的一个重要途径。内生菌也能通过增强植物吸收氮、磷等营养元素的能力，或产生拮抗物质或与病原菌竞争空间而达到促进植株生长的作用^[1]。

植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌^[2]。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。

前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌^[3]。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌^[4-5]、具有抗病虫害的生防菌^[6-9]。

在桉树内生真菌的研究主要集中在外生菌根（ECM）和VA菌根真菌的研究方面^[10]。桉属树种在自然界中既有外生真菌又有内生真菌，这在国内外均被证实，但内生真菌的自然感染率不高。弓明钦等^[11]进行桉树幼苗菌根接种及生长效应的研究中应用漏斗孢球囊霉（Glomus Mosseae）和地表球囊霉（G. epigaeum）两种菌进行高生长和直径生长比较。陈应龙^[10]用外生真菌彩色豆马勃和苏格兰球囊霉混合接种对尾叶桉的高生长、直径生长、干重的比较研究。前人的研究中应用菌株，多为外生真菌，同时也没有从促进磷吸收的根本因素去寻找内生真菌，以提高其科学性和可靠性^[12]。桉树的ECM菌根真菌主要包含担子菌亚门（Basidiomycotina）、子囊菌亚门（Ascomycotina）和接合菌亚门（Zygomycotina）等，VA菌根真菌主要包含接合菌亚门球囊霉目（Glomales）。证实能促进磷吸收的内生菌方面尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株桉树内生菌及其用于提高桉树抗耐低磷胁迫能力及促进磷吸收的用途。

本发明所述桉树内生菌为青霉（Penicillium sp.）菌株1，保藏号为CGMCC No. 4279。

该菌株1的分离、纯化步骤包括：

A、材料：采集野外邓恩桉和尾巨桉植株直径0.5cm以下的根、直径0.5cm以下的茎段和成熟叶；

B、消毒：叶片消毒采用70％酒精浸泡40s、0.1％升汞浸泡90s，茎段消毒采用70％酒精浸泡30s、0.1％升汞浸泡60s，根部消毒采用70％酒精浸泡50s、0.1％升汞浸泡120s；

C、分离：将经表面消毒的野外邓恩桉、尾巨桉植株的根、茎段和成熟叶接入真菌固体培养基进行内生真菌的繁殖；

真菌固体培养基：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；

D、将分离繁殖出的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后，从中选择得到单一菌种，通过桉树接种试验，进一步验证其具有促进桉树磷吸收活性后，鉴定并保存菌种；

点接种纯化：将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生真菌的接种效率与检出率。

本发明所述的桉树内生菌的制种方法即内生菌液的制备方法，是将上述的菌株1接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0～9.0×10⁶cfu/ml备用；