[发明专利]辅助鉴定人类星状病毒的方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定人类星状病毒的方法及其专用引物。

背景技术

星状病毒科(Astroviridae)是一种感染哺乳类及鸟类的病毒，它的基因体是不分节，正股的RNA，它没有套膜且蛋白壳体为正20面体，主要造成腹泻、下腹痛等症状，主要是借由水及饮食传播。星状病毒科包括哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)和禽星状病毒属(Avastrovirus)。哺乳动物星状病毒属的代表种为人类星状病毒(Human astrovirus)。禽星状病毒属的代表种为火鸡星状病毒(Turkey astrovirus)。

人星状病毒于1975年从腹泻婴儿粪便中分离得到，球形，28-30nm，无包膜，电镜下表面结构呈星形，有5-6个角。核酸为单正链RNA，7.0kb，两端为非编码区，中间有三个重叠的开放读码框架。星状病毒与腹泻密切相关，目前认为星状病毒是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因，仅次于轮状病毒。此外，老年人和免疫缺陷患者也是星状病毒感染的高危人群，人类免疫缺陷病毒感染者、接受骨髓移植及联合免疫缺陷患者发生星状病毒感染均已有报道。星状病毒亦是健康成年人发生胃肠炎的病因之一。该病毒呈世界性分布，粪-口传播，易感者为5岁以下婴幼儿，其中5％-20％为隐性感染。在温带地区，冬季为流行季节。病毒侵犯十二指肠粘膜细胞，并在其中大量增殖，造成细胞死亡，释放病毒于肠腔中。在急性期，粪中病毒可达1010病毒体克，是医院内感染的主要病原体。潜伏期3-4天，症状包括发热、头痛、恶心、腹泻，后者可持续2-3天，甚至更长。

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)是在实验过程中使核酸链通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，而达到检测目的。由于反应中使用了两对特异性引物，只有两对引物均与特异的靶序列结合时扩增反应才能进行，因此这种检测方法的特异性很高。其中一对特殊的引物的5’端含有一端与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就形成了一个类似哑铃状回文结构，这种结构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，从而保证了扩增的持续进行，最终，扩增产物在核酸电泳胶上形成连续的梯状条带。从RT-LAMP的原理和特点上不难看出，该方法在RNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方面无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面：首先，它的检测时间可以缩短到两个小时以内，灵敏度可以达到检测10个拷贝左右的病毒核酸分子；除了应用一些常用的聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作；第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，在实验设施中反转录与扩增过程在恒温条件下一步完成，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会；第三，扩增反应只有在四条引物完全与识别的靶序列中六个结合区匹配的情况下才能顺利进行，从而大大提高了反应的特异性；第四，RT-LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸酶沉淀，因此肉眼可观察到阳性反应管中的白色混浊物；第五，也可在RT-LAMP反应体系中加入HNB染料，即可通过观察颜色变化指示阳性结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定人类星状病毒的方法及其专用引物。

本发明提供的辅助鉴定人类星状病毒的专用引物，为如下(a)或(b)：

(a)由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的专用引物；

(b)由序列表的序列1所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列2所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列3所示DNA的反向互补DNA和序列表的序列4所示DNA的反向互补DNA组成的专用引物。

所述专用引物可用于制备辅助鉴定人类星状病毒的试剂盒。

本发明还保护一种辅助鉴定人类星状病毒的试剂盒，包括所述专用引物。

所述试剂盒还可包括阳性质粒；所述阳性质粒可为含有序列表的序列5所示DNA的质粒。所述阳性质粒具体可为将星状病毒A-X3178G基因(核苷酸如序列如序列表的序列5所示)反向插入pGH载体的SmaI酶切位点得到的重组质粒。

所述引物或所述试剂盒可用于辅助鉴定人类星状病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定人类星状病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测病毒的RNA；

(2)将步骤(1)提取的RNA采用所述专用引物进行环介导逆转录等温扩增；