[发明专利]优化的草鱼α干扰素编码基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种优化的草鱼α干扰素编码基因及其应用。

背景技术

近年来，我国高密度、集约化水产养殖方式导致了各种病害频繁发生，特别是各种病毒性疾病，已经成为制约我国水产养殖产业可持续性发展的关键因素。长期以来人们一直使用各种化学物品来进行鱼类病毒性疾病的治疗，但是此类药物极易导致药物残留超标，再加上国内外对食品健康的要求越来越高，使得水产养殖业步履维艰，于是寻找新的安全无残留的抗病毒渔药已然是迫在眉睫。

鱼类是低等脊椎动物，非特异性免疫占有重要地位。干扰素系统作为一种高效的非特异性免疫因子，在鱼体的抗感染免疫中发挥重要的作用。目前国内外已有鱼干扰素基因序列、氨基酸序列方面的报道，并实现了干扰素基因在原核或真核表达系统中的发酵表达，为鱼类基因工程干扰素的规模化生产和应用提供了依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种优化的草鱼α干扰素编码基因及其应用。

本发明提供的优化的草鱼α干扰素编码基因为序列表的序列2所示的DNA。

含有序列表的序列2所示的DNA的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为将序列表的序列2所示的DNA插入pBV220的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组载体优选为将序列表的序列2所示的DNA插入pBV220的BamHI和EcoRI位点间得到的重组质粒。

所述重组菌可为将序列表的序列2所示的DNA导入大肠杆菌DH5α得到的重组菌。所述重组菌优选为将所述重组载体导入大肠杆菌DH5α得到的重组菌。所述重组菌最优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DH5α/pBV220-GCIFNα，已于2010年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.4111。

本发明还保护一种制备α干扰素的方法，是将所述重组菌，40～43℃诱导4～8小时(优选42℃诱导6小时)，然后破碎菌体，收集包涵体、洗涤包涵体、溶解包涵体并将其复性，得到含有α干扰素的溶液。

所述方法还包括将所述含有α干扰素的溶液进行蛋白纯化的步骤。

所述蛋白纯化的方法如下：将所述含有α干扰素的溶液用醋酸调节pH值为5.5-9.5，采用HiLoad 26/10 SP Sepharose High Performance进行阳离子交换层析，用洗涤缓冲液甲冲洗5个柱体积，然后用洗涤缓冲液乙洗脱1-10个柱床体积，收集280nm光照下紫外吸收值大于200的洗脱液，得到的溶液即为α干扰素溶液；所述洗涤缓冲液甲的pH为5.5-9.5，由Tris·Cl、NaCl和水组成，Tris·Cl浓度为0.1mol/L，NaCl浓度为0-150mM；所述洗涤缓冲液乙的pH为5.5-9.5，由Tris·Cl、NaCl和水组成，Tris·Cl浓度为0.1mol/L，NaCl浓度为150-2000mM。

所述蛋白纯化的方法具体如下：将含有草鱼α干扰素的溶液用醋酸调节pH值为6.5，采用HiLoad 26/10 SP Sepharose High Performance(内径26mm，床高100mm，GE LifeScience)进行阳离子交换层析；样品以1ml/分钟的速度加入层析柱中，用洗涤缓冲液甲以5ml/分钟的速度冲洗5个柱体积，用洗涤缓冲液乙以5ml/分钟的速度洗脱3个柱体积，收集280nm光照下紫外吸收值大于200的洗脱液，得到的溶液即为α干扰素溶液(可用0.22um滤膜进行过滤除菌)；所述洗涤缓冲液甲的pH为6.5，由Tris·Cl、NaCl和水组成，Tris·Cl浓度为0.1mol/L，NaCl浓度为50mM；所述洗涤缓冲液乙的pH为6.5，由Tris·Cl、NaCl和水组成，Tris·Cl浓度为0.1mol/L，NaCl浓度为500mM。

所述方法制备得到的α干扰素溶液也属于本发明的保护范围。

所述DNA、所述的重组载体、所述重组菌、所述表达盒或所述转基因细胞系均可用于制备α干扰素。

所述DNA、所述的重组载体、所述重组菌、所述表达盒或所述转基因细胞系均可用于制备病毒抑制剂。所述病毒可为传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和/或草鱼出血病病毒(GCHV)。所述染性造血器官坏死病毒(IHNV)具体可为WRAC毒株。

所述DNA、所述的重组载体、所述重组菌、所述表达盒或所述转基因细胞系均可用于制备如下(a)和/或(b)；