[发明专利]一种制备白杨素的方法

说明书

技术领域：

本发明天然产物分离领域，尤其是涉及一种采用酶解方法制备白杨素的方法。

背景技术：

白杨素又称白杨黄素，化学名称5，7-二羟基黄酮，淡黄色棱柱形结晶(由甲醇中结晶)，熔点285℃。溶于氢氧化碱溶液，微溶于乙醚、乙醇和氯仿，不溶于水。

研究表明白杨素具有抗氧化、抗病毒、抗高血压、降血糖和抑制芳香酶活性的作用，特别受人关注的是其具有肿瘤预防和治疗作用。白杨素的抗肿瘤作用主要包括：(1)抗肿瘤细胞增殖；(2)诱导肿瘤细胞凋亡；(3)逆转肿瘤细胞多药耐药作用；(4)抗基因突变作用。

现有提取白杨素多是从紫薇科植物木蝴蝶中提取，但是木蝴蝶药材白杨素含量较低。而三叶海棠叶中白杨素苷含量较高，高达5％左右，可以经过水解或酶解成白杨素，原料易得。

从三叶海棠叶中提取白杨素，现有工艺是先提取白杨素苷再酸水解得到白杨素。如文献“HPLC法测定三叶海棠叶中白杨素苷含量”，该文献公开的方法是取三叶海棠叶，加12倍量的丙酮超声提取3次，每次1h，合并提取液，回收丙酮，其提取物混合聚酰胺后，干法上聚酰胺柱，依次用水，10％、20％、30％、40％、50％、70％、95％乙醇洗脱，以TLC跟踪检测，合并相同的馏分，浓缩部分溶剂，析出结晶，结晶再以丙酮进行重结晶，得针状浅黄色结晶，即为白杨索苷。取该结晶适量用6％硫酸加热水解，析晶，丙酮重结晶即得白杨素。酸水解产生较多废酸水，污染较严重。

发明内容：

本发明要解决技术问题是提供一种用生物酶解制备白杨素的方法，该方法反应条件温和，对环境污染小。

为解决上述问题，本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种制备白杨素的方法，其特征在于包含以下步骤：

1)取三叶海棠叶粉碎，加酸性水溶液拌湿，加入2-5‰生物酶酶解，制得酶解原料；

2)把上述酶解原料加入5-10倍量80-90％乙醇溶液回流提取2-3次，提取液减压回收浓缩至醇浓度20-40％，放置结晶；

3)滤出上述结晶物，乙醇溶解聚酰胺拌样，挥干乙醇装柱，乙醇溶液梯度洗脱，薄层检测，收集高浓度流分，减压浓缩，放置结晶，滤出结晶物90-99％乙醇回流溶解结晶，结晶物干燥即得高含量白杨素产品。

所述步骤1)中酸性水为pH3-5的盐酸或硫酸水溶液，生物酶可选纤维素酶、淀粉酶和β-葡聚糖苷酶中的一种或几种，添加量为原料的1-2‰，酶解时间24-48小时，酶解温度35-50℃。

所述步骤3)中乙醇梯度洗脱为4-6BV40-50％乙醇→70％乙醇。

本发明优势在于采用三叶海棠叶，白杨素苷含量高，原料便宜易得；生物酶解反应温和，而且酶解后原料更易提取，不产生更多废液酸水，提取过的原料更易降解；整个工艺未使用毒性有机试剂，所得产品符合药品生产要求。

下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

具体实施方式：

实施例1：

取干燥的三叶海棠叶粉碎，称量1kg，加适量pH3盐酸水溶液拌湿，再加入2g β-葡聚糖苷酶拌匀，保温酶解原料35小时，温度控制35-50℃。酶解原料加入10kg90％乙醇溶液回流提取2次，每次1小时，合并提取液减压浓缩至醇浓度40％，放置结晶，过滤得粗结晶物95g。把粗结晶物用90％乙醇回流溶解，取20g聚酰胺拌样，挥干乙醇，与200g聚酰胺装柱，取1L50％乙醇溶液洗脱杂质，再取70％乙醇溶液洗脱有效成分，薄层检测，收集白杨素高浓度流分，减压浓缩至醇浓度30％，放置结晶，滤出结晶物用99％乙醇回流溶解，浓缩至1/2体积放置结晶，结晶物滤出干燥，得白杨素产品18.2g，含量95.6％(HPLC检测)。

实施例2：

取干燥的三叶海棠叶粉碎，称量1kg，加适量pH5盐酸水溶液拌湿，再加入5g纤维素酶拌匀，保温酶解原料40小时，温度控制35-50℃。酶解原料加入8kg80％乙醇溶液回流提取3次，每次1小时，合并提取液减压浓缩至醇浓度30％，放置结晶，过滤得粗结晶物102g。把粗结晶物用90％乙醇回流溶解，取30g聚酰胺拌样，挥干乙醇，与200g聚酰胺装柱，取1.2L40％乙醇溶液洗脱杂质，再取70％乙醇溶液洗脱有效成分，薄层检测，收集白杨素高浓度流分，减压浓缩至醇浓度30％，放置结晶，滤出结晶物用90％乙醇回流溶解，浓缩至1/2体积放置结晶，结晶物滤出干燥，得白杨素产品16.3g，含量97.2％(HPLC检测)。

实施例3：