[发明专利]沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒、制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及肠道病原菌中沙门菌与志贺菌的同步分离和鉴定方法，特别涉及利用选择性分离培养基生长相应的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验鉴定2种肠道病原菌的试剂盒和使用方法。

背景技术

现阶段使用的沙门菌、志贺菌常规分离方法在实际工作中使用传统分离培养基的批间质控要求繁琐、敏感性和特异性低，对疑似菌落筛选和鉴定所用自动化生化反应试剂材料的费用昂贵。中国专利申请200810047994.7公开了“一种同时快速检测沙门菌和志贺菌的方法”，该发明属于食源性致病菌的快速检测技术，具体说是一种对沙门菌和志贺菌同时进行检测的环介导等温DNA扩增（LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION，LAMP）检测方法。包括由样品处理试剂、LAMP反应试剂、BST DNA聚合酶的大片段、琼脂糖、溴酚蓝上样缓冲溶液、溴化乙锭溶液组成的试剂的配制，以及扩增产物的检测和沉淀产生的检测程序。其步骤是：首先设计特异性引物；其次是提取样品DNA；第三是配制反应体系。该法较之目前采用的传统细菌培养方法、免疫检测方法和其它分子生物学方法具有操作简单、快速且灵敏特异的优点。可应用于食品和其它样品中沙门菌和志贺菌的同时快速检测。但是该方法筛选病原菌还存在一定局限性，即筛选到的阳性结果可能无法通过细菌学方法分离到；也可能因为存在死菌而获得假阳性结果；另外，需设计特异性引物及提取DNA步骤较为复杂，筛选结果判断还不够直观。本发明是基于传统细菌学技术简化，经提炼、加入创新材料组合成的检测程序，包括对样品的预处理和增值，使用专一性、选择性平板分离出沙门菌和志贺菌的典型菌落，结合简易生化和特异性酶-底物反应组合试验同时鉴定沙门菌和志贺菌的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的传统分离平板和鉴定技术单纯依赖生化鉴定为主的方法更具有综合成本低、操作简单、快速、无需依赖特殊仪器且有特异性、准确性及阳性预期值高的优点。适用粪便（或者粪便拭子）、食品、环境水样等多种增菌标本中沙门菌、志贺菌的同步分离和鉴定。更在原理设计、操作人员与实验室要求方面和分子生物学方法有本质的区别，且筛检的方位更为广泛、针对性更强，所以与中国专利申请200810047994.7不存在相似性与可比性。

发明内容

本发明的目的是提供一种一次可同步分离沙门菌和志贺菌并利用生化和酶反应试验鉴定的沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒、制备和应用。主要解决现有沙门菌和志贺菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。本发明用2种不同选择性增菌液及专一性的选择性分离平板配合简单的糖生化发酵反应模式和细菌特异性酶-底物反应特征建立一套行之有效的分离和特异性鉴别试验，达到对沙门菌和志贺菌同步筛选分离和简易鉴定的效果。

本发明的技术方案为：沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒，包括：

1、通用型非选择性增菌液：胰酪胨大豆胨肉汤（TSB）。成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K₂HPO₄ 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅压力15分钟（121℃）灭菌后分装225mL/瓶备用。

2、10倍浓缩通用型非选择性增菌液：胰酪胨大豆胨肉汤（TSB）。成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K₂HPO₄ 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水100ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经压力15磅15分钟（121℃）灭菌后分装10mL/瓶备用。

3、沙门菌增菌液：亚硒酸盐磺绿-磺胺增菌液（SBG）。成分：酵母浸出物5.0g，蛋白胨5.0g，D-甘露醇5.0g，牛磺酸钠1.0g，磺胺抑制剂0.5g，亚硒酸钠4.0g，KH₂PO₄2.65g，K₂HPO₄1.02g，磺绿5.0mg，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.2±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。煮沸3次后分装9mL无菌试管备用。