[发明专利]一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法

权利要求书

1.一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，其特征在于，具体步骤为：

A)将0.25％胰酶和0.1mg/mL的胶原酶iv配制在含有1mM CaCl₂和20％KSR的PBS溶液中，用其消化ES克隆，使其成为5-10个细胞的ES细胞团。消化后悬浮在含有WNT抑制剂DKK1(100ng/mL)和NODAL抑制剂LEFTY-A(500ng/mL)的无血清培养基中；

B)将ES克隆短期孵育在明胶包被的培养皿中以去除饲养层细胞；

C)ES细胞团在非粘附细菌培养皿中以每毫升6.7×10²个细胞团的浓度在连续分化培养基中培养。

2.根据权利要求1所述的一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，其特征在于，步骤C中所述连续分化培养基包括：

(1)DMEM/F12，20％KSR，0.1mM NMAA，2mM L-glutamine培养基；

(2)G-MEM，20％KSR，0.1mM NMAA，1mM pyruvate，0.1mM BME培养基；

(3)G-MEM，15％KSR，0.1mM NMAA，1mM pyruvate，0.1mM BME培养基；

3.根据权利要求2所述的一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，其特征在于，

在所述(1)培养基中培养2天；

在所述(2)培养基中培养4天；

在所述(3)培养基中培养8天；

在所述(4)培养基中培养6天；

接着，添加WNT的抑制剂DKK-1(100ng/mL)和NODAL的抑制剂LEFTY-A(500ng/mL)。

4.根据权利要求3所述的一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法，其特征在于，每平方厘米10-15个ES细胞簇重新铺在含有多聚赖氨酸、层粘连蛋白和纤维连接蛋白的8孔培养玻片上，在含有10％KSR的ES分化培养基(G-MEM，0.1mM NMAA，1mM pyruvate，0.1mM BME)中培养。