[发明专利]一种新型β-甘露聚糖酶基因的克隆及重组酶的制备

权利要求书

1.一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的新型β-甘露聚糖酶基因，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.如权利要求1所述的新型β-甘露聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

3.A.usamii E001新型β-甘露聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的获取方法：

(1)β-甘露聚糖酶基因3′端mRNA序列的克隆：首先对A.aculeatus、A.sulphureus和T.reesei β-甘露聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列；再对它们的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物Man5A-3F1和Man5A-3F2；

Man5A-3F1：5′-GCTACTT(C/T)GC(C/G)GG(A/G/C)AC(G/C)AAC-3′

Man5A-3F2：5′-TACTGG(A/T)(T/G)C(G/T)(G/C)(T/G)TTCCT(G/C)AC-3′

以A.usamii E001总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以Man5A-3F1和M13 Primer M4为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 90s)，72℃ 10min；以Man5A-3F2和M13 PrimerM4为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃ 2min，30个循环(94℃ 30s，53℃ 30s，72℃90s)，72℃ 10min；目的条带经克隆、测序，得到Aus man5A 3′端mRNA序列；

(2)β-甘露聚糖酶基因5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aus man5A 3′端mRNA序列，设计两条反向引物Man5A-5R1和Man5A-5R2；

Man5A-5R1：5′-ATTGTCGATTTGCCGTCCTG-3′

Man5A-5R2：5′-GCAGTTGGTACCAGACTGTG-3′

以合成的cDNA第一条链为模板，5′-Full RACE Kit的Outer Primer和Man5A-5R1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃ 3min，30个循环(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s)，72℃ 10min；以Inner Primer和Man5A-5R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃ 3min，30个循环(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s)，72℃ 10min；目的条带经克隆、测序，得到Ausman5A 5′端mRNA序列；

(3)β-甘露聚糖酶基因5′端调控序列的克隆：以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，第一轮PCR以T-PrimerF和Man5A-5R1为引物，其反应条件为：94℃ 4min，30个循环(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s)，72℃ 10min；第二轮PCR以T-PrimerF和Man5A-5R2为引物，其反应条件为：94℃，4min，30个循环(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s)，72℃ 10min；目的条带经克隆、测序，得到Aus man5A 5′端调控序列；

(4)β-甘露聚糖酶基因3′端调控序列的克隆：基于上述得到的Aus man5A 3′端mRNA序列，设计两条正向引物Man5A-3F3和Man5A-3F4；

Man5A-3F3：5′-GGGAATACTATCTACTATGGG-3′

Man5A-3F4：5′-GTGATTATCAGTGCCTGGTG-3′

以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，第一轮PCR以Man5A-3F3和T-PrimerR为引物，其反应条件为：94℃ 4min，30个循环(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s)，72℃ 10min；第二轮PCR以Man5A-3F4和T-PrimerR为引物，反应条件为：94℃ 4min，30个循环(94℃30s，55℃ 30s，72℃ 60s)，72℃ 10min；目的条带经克隆、测序，得到Aus man5A 3′端调控序列。

4.A.usamii E001新型β-甘露聚糖酶工程菌的构建和表达方法：

(1)构建含编码Aus Man5A成熟肽基因的表达质粒：以合成的cDNA第一条链为模板，第一轮PCR以Man5A-F和M13 Primer M4为引物，反应条件为：94℃ 2min，30个循环(94℃30s，53℃ 30s，72℃ 90s)，72℃ 10min；第二轮PCR以Man5A-F和Man5A-R为引物，反应条件为：94℃ 2min，30个循环(94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 90s)，72℃ 10min；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序结果正确的pUCm-T-man5A与pPIC9K质粒均用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组表达质粒pPIC9K-man5A，并对表达质粒进行测序鉴定；

(2)GS115/man5A的构建、表达、产物纯化及活性测定：用SalⅠ对pPIC9K-man5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A；该基因工程菌用1.0％甲醇诱导表达96h，采用DNS法测得发酵液中重组β-甘露聚糖酶活性达452 IU/mL；发酵液经离心后的上清液为重组β-甘露聚糖酶粗酶液，该粗酶液经截留分子量为10,000 Da的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组β-甘露聚糖酶的分子量为45kDa；该重组β-甘露聚糖酶的最适作用温度75℃，最适作用pH 3.5，在pH 3.0-7.0、70℃以下稳定；金属离子Al³⁺、Ca²⁺对酶活性有明显的激活作用，而Ag⁺则具有很强的抑制作用。