[发明专利]飞秒激光诱变米根霉选育富马酸高产菌株的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物诱变技术领域，特别涉及利用飞秒激光诱变米根霉选育富马酸高产菌株的方法。

背景技术

进入21世纪以来，石油资源的供应已无法满足石油化工产业发展的需要，而且产品生产和使用过程中的污染问题一直得不到根治。因此迫切需要改变生产原料来源和变更加工路线。随着生物技术的不断进步与发展，生物基产品替代石油基产品已经成为时代的主流。某些一碳、二碳、三碳、四碳及多碳的生物基产品可以作为大宗化学品直接运用到现代化学工业中，从而解决环境、社会的可持续发展问题。

“米根霉”(英文名称“Rhizopus oryzae”)是一种根霉属丝状真菌，其发酵产物可提取富马酸(英文名“fumaric acid”)，富马酸是一种拥有两个羧基和一个双键的四碳二元羧酸，化学名称为：反丁烯二酸。

富马酸被美国能源部列为优先发展的十二种平台化合物之一，可以通过氨化、水合、加氢及异构等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、1，4-丁二醇、马来酸等化合物。同时富马酸也是一种含有双键的二元羧酸，作为重要的有机化工原料和精细化工产品被广泛应用于材料(树脂、涂料及增塑剂等)、医药、化工、食品及饲料添加剂等领域。

据统计2005年，全球的富马酸年产量为34万吨，其中我国的富马酸年产量已超过4万吨，由于菌种的生产能力弱等原因，未见生物发酵法生产富马酸的工业化实例，可见采用高效的飞秒诱变技术改良富马酸生产菌株迫在眉睫。

激光诱变技术在微生物诱变育种中的应用较为广泛，其作用于微生物细胞产生光、热、压力、点、电磁场、弱磁场作用等，改变了微生物细胞中DNA和RNA遗传密码的次序，引起变异。卢文玉等(卢文玉，闻建平，范晶华，曹博翔，孙冰.激光诱变玫瑰孢链霉菌结合链霉素抗性筛选法选育达托霉素高产菌株，微生物学通报，2006，33(3)：114-117)用He-Ne激光诱变处理玫瑰链霉菌，得到正突变株的达托霉素产量比原始菌株提高39％。马丽娟等(Lijuan Ma，Wenyu Lu，Zhendong Xia，Jianping Wen*，Enhancement ofdihydroxyacetone production by a mutant of Gluconobacter oxydans，BiochemicalEngineering Journal，2010；49(1)：61-67)用He-Ne激光诱变处理氧化葡萄糖酸杆菌，得到正突变株的DHA产量比原始菌株提高91.5％。韩建荣等(韩建荣，董仙芳.激光诱变青霉PT95原生质体选育类胡萝卜素高产菌株，微生物学通报，2002，29(2)：31-34)采用激光对青霉PT95菌株的原生质体进行了诱变处理，选育到一株类胡萝卜素提高28.3％的突变菌株。而把飞秒激光应用在生产富马酸菌种的选育方面，则未见相关专利和文献报道。

发明内容

本发明的目的是提出一种飞秒激光诱变米根霉选育富马酸高产菌株的方法，依此方法可以有效地提高富马酸的产量。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

1)将米根霉(ATCC 20344)，在室温下，制备10⁴～10⁶个孢子/mL的孢子悬液；

2)采用波长为800nm、重复频率为76MHZ的飞秒激光，在照射功率为5～40mW、照射距离6cm、激光束直径6mm下，对该孢子悬液辐照5～30s；

3)涂布平板培养，摇瓶筛选高产菌株。

所述的涂布平板培养的方法是：把经辐照处理的孢子悬液经无菌去离子水稀释100～10000倍后涂布于PDA培养基平板，35℃暗室培养至出现单菌落，再将每个单菌落分别挑取至一个PDA培养基平板中，用无菌去离子水洗下孢子接种于盛有40mL液体发酵培养基的250mL摇瓶，于33～35℃，180～220rpm摇床中培养60～84h，从而获得诱变的遗传性状稳定的纯种米根霉菌株。

所述的液体发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖80g、尿素0.1g、KH₂PO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、ZnSO₄·7H₂O 0.018g、FeSO₄·7H₂O 0.001、CaCO₃55g，溶解在1L蒸馏水中，初始PH为5.5