[发明专利]一种猪瘟病毒纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪瘟病毒的纯化方式，具体涉及从原代牛睾丸细胞繁殖猪瘟病毒的细胞液中纯化猪瘟病毒的方法。

背景技术

猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20世纪50年代中国首创了举世闻名的猪瘟兔化弱毒疫苗，随后创制了不同的疫苗制造工艺，如乳兔组织苗、牛体反应组织苗和猪瘟牛睾丸细胞苗等，应用比较普遍的是犊牛睾丸细胞苗。猪瘟弱毒疫苗是一株非常安全的弱毒疫苗，对各种年龄和品种的猪都没有副作用，并且有良好的免疫效力，它能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答，对不同基因型的猪瘟病毒株均能提供有效的免疫保护。但是一般用于动物的病毒性疫苗含有来源于动物组织、细胞和培养基的蛋白质、糖类、脂类及核酸等杂质成分，以及细胞代谢副产物等，易使接种动物产生过敏，持续发热等副作用。

国际专利WO 98/22588色谱层析的方法纯化来自于细胞培养的腺病毒；美国应用专利US20090123989描述了一种通过超滤的方法从细胞繁殖的含有腺病毒的溶液中纯化腺病毒的方法；采用离子交换和膜亲和层析的方法纯化病毒颗粒样腺病毒载体(Peixoto et al.，2008；Sellick，2006)，纯化禽流感病毒(Kalbfuss et al.，2007；Opitzet al.，2009；Opitz et al.，2007)。美国专利4725546，采用硫酸酯化的纤维素或者交联的脂多糖通过层析的方式纯化日本脑炎病毒，从而为治疗日本脑炎病毒提供良好的高纯度的疫苗。美国专利6207439，采用硫酸酯化的纤维素或者交联的脂多糖通过层析的方式纯化流感病毒，从而提高病毒纯度获得良好的疫苗。美国专利3874999通过MgSO₄沉淀含病毒液中的杂蛋白，而达到纯化病毒的目的。刘劲松等用兔抗牛睾丸细胞培养物的IgG琼脂糖4B偶联制备亲和层析柱，然后通过亲和层析免疫吸附除去PEG沉淀法部分纯化抗原中的残留牛睾丸细胞培养物成分。其结果表明，通过3次反向亲和层析柱的纯化抗原，其总蛋白去除率达76.9％(刘劲松等，1992)。

虽然对病毒的纯化方法有很多种，但是均存在一些缺点，例如MgSO₄沉淀法其对病毒的活性影响非常大，在高浓度的MgSO₄溶液中病毒被灭活；而利用亲和层析的方法虽然能够获得纯度较高的病毒，但是亲和层析的填料成本太高，在兽用疫苗中不能广泛使用。猪瘟病毒是单股RNA病毒，相对分子量为4×10⁶道尔顿。本病毒呈圆形颗粒状，其直径为38～44nm，核衣壳为对称的20面体立体结构。猪瘟病毒的抵抗力较强，血液中的病毒在37℃可存活7天，在细胞培养物中猪瘟病毒60℃10分钟就会失去活性。病毒在pH5-10的环境中稳定。目前，使用的猪瘟疫苗均为猪瘟病毒经过兔体弱化而形成的猪瘟弱毒疫苗。在工业化生产的过程中，均未经过对猪瘟病毒进行纯化。只有部分厂家经过病毒浓缩，例如膜过滤等方式去掉小部分杂蛋白或者细胞碎片等物质。这样，生产用于动物的病毒性疫苗含有来源于动物组织、细胞和培养基的蛋白质、糖类、脂类及核酸等杂质成分，以及细胞代谢副产物等，易使接种动物产生过敏，持续发热等副作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪瘟病毒纯化方式。

该猪瘟病毒纯化方法包括如下步骤：

1)对猪瘟病毒细胞培养液进行过滤；2)通过横向切留超滤浓缩方式对初滤的猪瘟病毒细胞液进行浓缩；3)使用阴离子交换层析柱对猪瘟病毒进行纯化。

所述的猪瘟病毒细胞培养液为原代牛睾丸细胞繁殖猪瘟病毒的细胞培养液。

其中步骤1)中对猪瘟病毒细胞液进行过滤的滤膜孔径为0.2～1.2μm。优选先采用1.0μm以上的滤膜，再采用0.2～0.45μm，更为优选为0.45μm孔径的滤膜。

其中步骤2)所述的对初滤的猪瘟病毒细胞液进行浓缩的倍数为10～40倍，优选为20倍。所述的横向切留超滤浓缩的浓缩膜孔径为1K～100K，优选为30～50K。

其中步骤3)所述的阴离子层析柱选自下述的层析树脂：UNOsphere Q、Marcro-prep High Q、Qsepharose^TM Fast Flow HiPrep16/DEAEFF、DEAE-SephadexA-25、CMSepharoseFastFlow，优选为Marcro-prep High Q。

本发明还提供阴离子交换层析纯化猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：

1)装层析柱