[发明专利]一种体外构建的气管替代品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物医学工程领域，具体涉及一种体外构建的气管替代品及其制备方法。

背景技术

组织工程学是应用生命科学和工程学的原理和方法，研究、开发用于修复、增进或改善人体各种组织或器官损伤后功能和形态的生物替代品的一门新兴科学。它的核心内容是体外三维细胞培养，基本方法是将细胞经体外扩增后与可降解生物材料相结合形成细胞——可降解生物材料复合体，用以替代受损组织器官。它具有形成具有生命力的活体组织，少量细胞修复大块缺损，并可按组织、器官缺损情况任意塑型等特点。目前有报道，体外构建组织工程化软骨、皮肤已获得成功，但组织工程化气管替代品尤其是带有完整上皮组织的气管替代品尚未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种体外构建的气管替代品及其制备方法。本发明在体外构建有上皮层和真皮层的上皮组织，所述的真皮层中包含由血管内皮细胞及成纤维细胞）。并将之贴附于气管替代品内面，制备组织工程化气管。本发明还可在组织工程化气管外层包裹大网膜，制备成类似“三明治”结构的气管替代品。

完整的上皮组织是理想的气管替代品所必须的，它可以阻止肉芽组织长入，防止管腔阻塞。而充足的血供是上皮组织存活的前提，正常气管粘膜下层有丰富的毛细血管网。正常组织再血管化主要有血管生成、血管发生两种形式。血管生成即局部血管再生是指正常组织血管内皮细胞通过降解血管基底膜，出芽生长进入再生组织基质，经过增生形成毛细血管。血管发生则由骨髓中血管内皮细胞在某些细胞因子刺激下游离至再生组织生成毛细血管。本发明同时利用上述两种再血管化方法，短时间内与受体血供再通，从而为组织工程化气管上皮提供血供。

本发明是通过下述技术方案实现的。先取患者皮肤标本，分离培养表皮细胞和成纤维细胞。血管内皮细胞可由患者骨髓、脂肪组织以及取动静脉血管获得。上述种子细胞体外培养扩增至所需细胞量后，先将成纤维细胞和血管内皮细胞混合接种于各类组织工程化皮肤支架材料上，构建成纤维细胞、血管内皮细胞——支架材料复合物。体外培养 7-10 天后再于其表面接种表皮细胞，构建组织工程化上皮组织。然后将所的组织工程化上皮组织贴附于各类人工气管代用品内侧面，构建组织工程化气管替代患者气管。

本发明组织工程化气管具有如下结构特点： 

1 ．组织工程化气管内层具有组织工程化上皮组织；

 2 ．组织工程化上皮组织，表皮层种植有上皮细胞（纤毛上皮细胞或鳞状上皮细胞），真皮层种植有成纤维细胞、血管内皮细胞；

3 ．组织工程化上皮组织真皮层中可加入 VEGF 、 ECGF 、 BFGF 等促血管生成因子，促进豁膜下层毛细血管网的形成，为上皮组织提供血供，防止上皮坏死肉芽组织增生；

4 ．外层是各类气管替代品，如组织工程管状软骨、人工合成材料气管替代品等；

5 ．组织工程化上皮组织中的支架材料包括脱细胞基质等生物材料，和聚轻基乙酸（ PGA ）等各类人工合成材料。

具体实施方式

实施例

组织工程化上皮组织的构建 

1 ）分离与培养表皮角朊细胞

取患者表皮修剪成宽 l-2mm 的条状，无钙镁 PBS 漂洗两次，表皮面朝上浸于 0.5 ％中性蛋白酶（DispaseⅡ）中 4 ℃ 过夜。将表皮从真皮上撕下后，剪碎，用 0.05 ％胰酶-0.53mM EDTA 在 37 ℃ 消化 20 分钟， 10ml 胰酶抑制剂终止消化。经 150 目不锈钢滤网过滤、离心、计数后制成单细胞悬液，按 3×10⁶/75cm²密度接种培养，无血清表皮细胞培养基（ GIBRO ，USA），另加牛垂体提取物和重组表皮细胞生长因子，在 37 ℃ ， 5 % CO₂，饱和湿度的培养箱中培养，培养液 3 天换一次。当细胞达到 60-75 ％密度融合时，经 0.05 ％胰酶 37 ℃ 消化 10 分钟，按 1 : 3 的比例传代培养。 

2 ）真皮成纤维细胞分离与培养

分离消化

将上述真皮碎块，在 0.2 ％的胶原酶 37 ℃ 消化 2 小时，经 150 目不锈钢滤网过滤，以 1200r / min 离心 5 分钟，弃去上清，加入无钙镁 PBS 清洗 3 次。加入含 10 ％胎牛血清的 DMEM 培养液 10ml ，混匀，台盼蓝染色计数。