[发明专利]一种生物活性物质批量定量检测的方法

说明书

技术领域

 本发明属于生物医学工程领域，具体的是涉及一种生物活性物质批量定量检测的方法。

背景技术

蛋白芯片是一种高密度的抗原抗体徽阵列，将大量特定的抗原或抗体有序地固定在玻璃或硅片上，大量、快速、平行地对相应的抗原或抗体进行定量、定性分析。蛋白芯片技术的成熟和应用将给本世纪的疾病诊断、新药开发、司法鉴定、农作物的优育优选、食品卫生监督、环境检测、国家安全防卫等领域带来一场革命；为人类提供高速、并行采集和分析个体生物信息强有力的技术手段，为生物信息学的研究提供重要的信息采集和处理平台。

发明内容

本发明针对上述现有技术的发展现状，其目的是在化学修饰玻片上同时进行荧光定量检测多种生物活性物质，将亲和素标记上荧光分子，通过与生物素标记的检测抗原或检测抗体反应，间接地增加待检铡物质的标记荧光分子数量，达到增加灵敏度的目的，经荧光扫描，可对生物活性物质进行固相荧光定量检测。

检测原理：

抗原或抗体经特定的缓冲液稀释，按一定的循序和排列用点样仪点在氨基修饰或醛基修饰的玻片上，经 37 ℃ 孵浴、 PBS-小牛血清封闭，甩干，得到检测芯片。血清或血浆中的生物活性物质被捕获在芯片上，经生物素标记的生物活性物质的单克隆抗体检测和荧光分子标记亲和素的信号放大，再经激光共聚焦荧光扫描仪扫描获得相关生物活性物质的荧光检测信号。

在同一玻片上可获得多个已知样品和未知样品的荧光检测信号，由于荧光信号的强弱与样品中含有该生物活性物质的量，有良好线性相关性。对不同浓度已知样品中各种生物活性物质的荧光强度与其相应的浓度进行线性回归，可以得到其回归线： Y = AX + B ，未知样品中对应生物活性物质的荧光信号代入对应回归线可得到相应的生物活性物质的量。

具体实施方式

为进一步说明多种生物活性物质在化学修饰玻片上同时进行荧光定量检测的方法及其在医学诊断上的应用及制备，参照下列买施例说明但不是以任何方式限制本发呢的应用。

实施例一 玻片氨基修饰和醛基修饰

本发明采用常规方法对玻片进行化学修饰，玻片分别浸入新配制的高锰酸钾洗液中过夜，用双蒸水清洗晾干。先后用 2 ％的氨丙基硅烷氨基化溶液处理 30 分钟，乙醇洗涤，干燥得到氨基修饰玻片。氨基修饰的玻片经 5 ％戊二醛溶液处理 60 分钟， PBS 溶液清洗，晾干，制成醛基化玻片。

实施例二 妇科肿瘤标志物芯片的制备

将妇科肿瘤标志物 CA 199 、 CEA 、 CA 125 、 CA 15-3 及β-HCG 的单克隆抗体固定在经化学修饰的玻片上制成蛋白芯片。具体方法如下：

选用以下抗体作为包被抗体：选用瑞士 CANAG 公司的 CA199 单克隆抗体 C192 , ( CAT.NO.103-1 ）、 CA15-3 单克隆抗体 Ma695 ( CAT.NO.204-01 ）、 CEA 单克隆抗体 CEA12-140-10 ( CAT.NO. 402-01 ）及 CA 125 单克隆抗体 0V197 ( CAT.NO.212-01 ) ，美国 BIODESIGN 公司的β-HCG单克隆抗体 E45527 ，各抗体的纯度达到 90 ％以上，免疫反应性应符合要求。

将以上抗体 0.01 M PBS( pH7.4 ）稀释至如下浓度： C192 为 0.6 mg/ml 、 Ma695 为 1.2 mg/ml 、 CEA 12-140-10 为 2.0 mg/ml 、 OV197 为 l.6mg/ml 、 E45527 为 1.0mg/ml 。分别加到 384 孔点样板中，用 GENEMACHINE 公司的点样仪 OMGRID 100 将各抗体按一定的循序和排列点在氨基修饰或醛基修饰的玻片上，经 37 ℃ 孵浴 3 小时， PBS-小牛血清封闭 12 小时，甩干即得妇科肿瘤标志物芯片。

实施例三 肿瘤标志物单克隆抗体的生物素标记及 CY3-亲和素

按照 sigma 的生物素标记试剂盒使用说明书操作，将 1 mg 的各种肿瘤标记抗体分别标记并经 Sephadex G25 纯化，得到标记产物。