[发明专利]水稻OsNAC编码序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的NAC家族转录因子的克隆、基因表达模式分析、转基因载体的构建、植物转化、转基因植株的获得，以及相应的表型和细胞水平鉴定。

背景技术

植物生殖发育的多个环节影响到果实和种子的大小和多少。因此，控制生殖发育的基因可以决定农作物的产量。植物生殖发育的环节包括花器官的发育，雄蕊细胞分裂和分化，减数分裂，及花粉发育，调节这些环节的基因可能会对产量有很大的影响。对植物生殖发育的功能基因的克隆及其功能的分析研究，将为提高作物产量提供候选基因。

根据拟南芥花药发育5~8期的芯片数据结果，发现ANAC092在两个花粉发育异常的突变体spl，ems中的表达量较野生型大量下调，推测其在花粉发育过程中起重要调控作用。该基因参与拟南芥的衰老和侧根形成过程，尚未有其在花粉发育过程中作用的报道。NCBI中通过BLASTn获得了该基因在水稻品种“日本晴”中的同源基因OsNAC（Os04g0460600，LOC_Os04g38720）。

NAC家族转录因子是植物特有的一大类转录因子，其在植物的生长发育中主要参与形态建成，包括顶端分生组织的形成，侧根的形成，次生壁的形成等，另外NAC家族还参与植物的生物逆境和非生物逆境反应。尚未有其参与花粉发育的报道。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的水稻OsNAC在花粉发育中功能的研究。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的水稻功能基因OsNAC，该基因是NAC家族转录因子。

本发明的第二目的是提供这种水稻蛋白OsNAC编码序列在参与花粉发育中的应用。

本发明一方面提供一种水稻功能基因OsNAC，该基因是NAC家族转录因子，能参与花粉发育，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明还提供一种DNA分子，该序列编码具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽。

本发明一方面提供一种克隆出编码OsNAC的开放阅读框的方法，序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的105 ~ 1136bp，ORF长度为1032bp（红色字符标识出起始密码子和终止密码子）。

本发明还提供了一种检测OsNAC mRNA时空表达模式的方法，其步骤如下：

1、取萌发5d的水稻幼苗的根，花粉发育早期减数分裂时期的花序和花粉粒形成时期的花序，固定，石蜡切片。

2、利用OsNAC开放读框的3’端和3’UTR的特异序列（SEQ ID NO.1所示序列的1020bp ~ 1244bp）设计特异引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，合成探针，杂交显色。

本发明还提供一种通过Realtime PCR检测OsNAC表达量的方法，它包括用SEQ ID NO.1所示序列的1020bp ~1244bp为模板设计引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6， Realtime PCR定量分析水稻不同器官中和不同激素，胁迫处理下水稻体内OsNAC的表达量的变化。

本发明还提供所述的编码NAC家族转录因子在参与花粉发育过程中的应用。包括：

将所述的编码NAC家族转录因子序列转入拟南芥，分析其对花粉发育的功能，具体步骤如下：

（1）将编码序列可操作的连接于植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1序列ORF框的表达载体；

（2）将步骤（1）中的表达载体转化拟南芥；

（3）通过抗生素筛选，RT-PCR鉴定，获得转基因阳性单株，转基因植物的花粉发育异常，花粉粒含量减少。

本发明还提供一种用于鉴定是否存在OsNAC核苷酸序列的方法，它包括用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示ORF框的特异引物对转基因拟南芥基因组DNA进行PCR反应，PCR反应体系中添加5%的DMSO，可以提高PCR反应的特异性，然后通过检测是否扩增出目的片段来判断是否含有OsNAC核苷酸序列。

附图说明