[发明专利]含阳离子氨基酸多肽修饰的纳米磷酸钙基因载体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种非病毒基因载体的制备方法，具体为涉及一种含阳离子氨基酸多肽修饰的纳米磷酸钙基因载体的制备方法。

背景技术

基因治疗成为一些重大疾病如癌症、心血管病、白血病、艾滋病等很有发展前途的治疗方法，特别是，近年来非编码RNA的研究成为目前功能基因组研究的热点，基于此靶点研发的寡核苷酸药物将成为新一代肿瘤治疗的新药。然而，寡核苷酸易被体内核酸酶降解，因而其体内稳定性差，另一方面，寡核苷酸分子带负电，难以直接透过细胞膜进入细胞，还有，核酸药物要实现其临床应用，必须对肿瘤组织或细胞具有特异识别性，具有良好生物相容性、保护功能、载药性能及缓释性能和靶向给药性能的载体成为寡核苷酸实现临床应用的关键问题。基于以上理由，研究开发安全、高效的基因药物载体具有非常重要的意义。

目前，在基因治疗中采用的载体有两种类型:病毒载体和非病毒载体,其中病毒载体高效但易引起免疫反应，安全性较差，非病毒载体毒性低，效率相对较低，因而研究如何改善非病毒载体的效率已成为当今基因治疗载体的研究方向。脂质体自1987年Felgner首次作为基因转运载体以来已成为研究最为广泛的非病毒载体，脂质体具有广谱、毒性较低和效率较高等特点，DC-Chol/DOPE是被第一个批准用于人体的脂质体。脂质体的化学结构、辅助脂质的添加、尺寸大小、电荷比等是影响其转染效率的关键因素。阳离子聚合物特别是可生物降解的天然阳离子聚合物，近年来得到了广泛关注，典型的如聚乙烯亚胺（PEI)、聚酰胺-胺树枝状高分子（PAMMA)，与脂质体比，效率相当，但毒性相对较高，化学结构、尺寸大小、电荷比等也是影响其转染效率的主要因素。

磷酸钙共沉淀法由于操作简单、成本低、生物降解性能好和毒性低，至今仍然是广泛使用的非病毒转染载体之一。但其颗粒尺寸大小难控制，且稳定性差，因而其转染效率相对较低，而且再现性差，一直以来不适合作为体内转染载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种尺寸稳定、转染效率高的含阳离子氨基酸多肽修饰的纳米磷酸钙基因载体的制备方法。

本发明含阳离子氨基酸多肽修饰的纳米磷酸钙基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制150 ~350 mM的CaCl₂水溶液，经过滤灭菌后室温下储存；

（2）配制2×HBS水溶液，其中含120~160 mM NaCl，1.2~1.6 mM Na₂HPO₄和30~70 mM HEPES，室温下用NaOH溶液调节到pH 7.00~7.20，经过滤灭菌后室温下储存；

（3）配制10~30 mM浓度的含阳离子氨基酸多肽水溶液，调pH值到7.00~7.20，过滤灭菌后0~4 ^oC储存；

（4）将2×HBS和含阳离子氨基酸多肽溶液按1：0~1：3的体积比混合得到溶液a，再将pEGFP-C1质粒与CaCl₂共孵育5~9分钟后，在旋涡震荡条件下将其以大约每秒1滴的速度滴入所述溶液a中,使质粒浓度达20~40 ug/mL，放置15~25分钟后得到含阳离子氨基酸多肽改性磷酸钙（CP-CaP）。

所述含阳离子氨基酸多肽为含阳离子精氨酸的多肽。

所述含阳离子精氨酸的多肽为含黏附多肽RGD的GRGDS多肽或硫酸鱼精蛋白（PS）和含九个精氨酸的穿膜多肽（R9）。

本发明制备方法简单可行，使用的多肽都为生物分子，具有生物相容性好和毒性低等特点，而且，所述多肽都含阳离子精氨酸，在控制磷酸钙颗粒尺寸的同时，还能促进其与细胞表面的相互作用，有利于磷酸钙纳米颗粒通过内吞作用转运基因进入细胞，提高基因转染效率，因此，与共沉淀法磷酸钙比，含阳离子氨基酸多肽修饰的纳米磷酸钙将是一种更好的基因转染载体。

附图说明

图 1是共沉淀法磷酸钙基因载体（CaP）转染NIH 3T3细胞效果图。

图 2是含GRGDS多肽修饰的纳米磷酸钙基因载体（GRGDS-CaP）转染NIH 3T3细胞效果图。

图 3是共沉淀法磷酸钙基因载体（CaP）转染293FT细胞效果图。

图 4是含硫酸鱼精蛋白修饰的纳米磷酸钙基因载体（PS -CaP）转染293FT细胞效果图。

图 5是共沉淀法磷酸钙基因载体（CaP）转染HEK 293细胞效果图。

图 6是含穿膜多肽（R9）修饰的纳米磷酸钙基因载体（R9-CaP）转染HEK 293细胞效果图。

图 7是原子力显微镜观察共沉淀法磷酸钙基因载体CaP。