[发明专利]一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法

权利要求书

1.一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法，其特征在于，包含步骤：

1)将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，加入5-7mol/l盐酸，130℃-160℃水解，将水解后的溶液移入蒸发皿中，用水洗涤，将洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至量瓶中，加入0.05-0.15mol/L盐酸溶液稀释，摇匀、离心后取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液；

2)取6种氨基酸对照品：L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸，将以上6种氨基酸对照品加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，制得氨基酸混合标准品溶液；

3)将步骤1)所述驴胶补血制剂待测品溶液和步骤2)所述基酸混合标准品溶液分别加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液中，混匀、静置后分别加入正己烷，再次混匀、静置后分别取其下层溶液，进行过滤，得衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液；

4)吸取步骤3)获得的衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液注入液相色谱仪，进行驴胶补血制剂中氨基酸的测定，其中，色谱条件为：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈与醋酸钠、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾三种中的任意一种或两种的组合，流动相B为乙腈-水，检测波长为254nm，流速为1.0ml·min^-1，柱温为30℃，按下表中的梯度进行洗脱：

5)根据步骤4)所得色谱图计算驴胶补血制剂中L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，精密称定，加入5-7mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30分钟使其溶解，130℃-160℃水解，放冷，移入蒸发皿中，用10ml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至量瓶中，加入0.05-0.15mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，离心后取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，精密称定，加入6mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30分钟使其溶解，150℃水解1小时，放冷，移入蒸发皿中，用10ml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，3000r/min离心5分钟取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)具体为：取6种氨基酸对照品：L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸，将以上6种氨基酸对照品加入0.1mol/L盐酸溶液溶解制成每1ml分别含L-谷氨酸73.1μg、L-羟脯氨酸86.4μg、甘氨酸0.1609mg、L-丙氨酸64.8μg、L-精氨酸59.3μg、L-脯氨酸93.9μg的混合溶液，即得氨基酸混合标准品。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)具体为：将步骤1)所述驴胶补血制剂待测品溶液和步骤2)所述基酸混合标准品溶液分别置10ml离心管中，加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯-乙腈溶液1.0ml，1mol/L三乙胺-乙腈溶液1.0ml，漩涡混合1分钟，室温放置1小时后，加入4ml正己烷，振摇，漩涡混合1分钟后，放置10分钟，取下层溶液，微孔滤膜滤过，即得衍生化的标准品溶液和衍生化的待测品溶液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，流动相A是乙腈-醋酸钠。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)中，流动相A中，醋酸钠的浓度为0.1mol/L。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，流动相A中，乙腈与0.1mol/L醋酸钠的比例为3∶97。

9.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，流动相B中，乙腈与水的比例为4∶1。