[发明专利]一株酿酒酵母及其构建方法与应用

权利要求书

1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2，该菌株2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号：CGMCC NO.4355。

2.权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2的构建方法，步骤如下：

(1)以啤酒酵母的DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，得到基因PGK1的启动子PGK1P，然后用内切酶KpnⅠ和BamHⅠ双酶切启动子PGK1P和质粒pUC18，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-P；

(2)以啤酒酵母的DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，得到IAH1基因片段，然后用内切酶BamHⅠ和SmaⅠ双酶切IAH1基因片段和步骤(1)制得的质粒pUC18-P，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-PI；

(3)以啤酒酵母的DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，得到ADH1基因的终止子片段，然后用内切酶SmaⅠ和EcoRⅠ双酶切ADH1基因的终止子片段和步骤(2)制得的质粒pUC18-PI，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-PIT；

(4)以质粒pUG6为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，得到KanMX基因片段，然后用内切酶SalⅠ和KpnⅠ双酶切KanMX基因片段和步骤(3)制得的质粒pUC18-PIT，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-KPIT；

(5)将步骤(4)制得的质粒pUC18-KPIT和酵母整合载体YIP-5分别用内切酶SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，然后用连接酶连接，得到载体YIP-KPIT；

(6)将步骤(5)制得的载体YIP-KPIT电击转化酿酒酵母感受态细胞，转化的酿酒酵母细胞涂布筛选平板，28℃培养72h后进行克隆子鉴定，选取阳性菌株，即得酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30循环；最后72℃延伸7min。

4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，30循环；最后72℃延伸7min。

5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，30循环；最后72℃延伸7min。

6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 75s，30循环；最后72℃延伸7min。

7.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中筛选平板组分如下：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂，500μg/mL G418，余量水。

8.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述啤酒酵母购自安琪酵母股份有限公司，商品名称：安琪啤酒高活性干酵母，货号：80000005。

9.权利要求1所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2在啤酒酿造中的应用。