[发明专利]一种实时荧光定量PCR检测花生LOX基因mRNA表达水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因表达水平的检测方法，尤其涉及一种实时荧光定量PCR检测花生LOX基因mRNA表达水平的方法。

背景技术

脂肪氧化酶(LOX)是植物体内重要的限制性酶，是茉莉酸合成代谢第一个关键酶，与植物体的新陈代谢与组织防御有着十分密切的关系(Gloria B.Burow.Harold W.Gardner2A peanut seed lipoxygenase responsive to Aspergillus colonization[J].Plant Molecular Biology 42：689-701，2000.)。花生中脂氧合酶含量的变化则能够提高花生对于外源真菌入侵的抗性，并且与植物体被动防御功能的产生有着十分重要的相关性。

植物LOX基因的表达行为具有多样性和复杂性，其表达因不同物种、不同组织器官、不同外界条件而表达特性各异，与植物的生长发育阶段也密切相关。实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号来实时监测产物量的变化。SYBR Green I实时定量PCR是PCR定量技术的一种，可以对基因扩增的起始模板的拷贝数进行精确的定量，还可以通过熔解曲线判断扩增产物的特异性，是一种灵敏度高、特异性好的检测技术。花生LOX基因已有研究表明在花生抗黄曲霉中发挥作用，但其生物体内循环代谢机理仍不清楚。我们应用SYBR Green I实时定量PCR技术，建立检测花生LOX基因mRNA表达水平的方法，对于阐明LOX基因表达的作用机理具有一定指导作用。

mRNA表达水平检测是从基因水平研究生理、病理反应的一项基本技术。目前最常规的方法包括Northern杂交、核糖核酸酶保护分析法等，但常规的方法均需要消耗很长时间，而且这些方法均存在一些不足。

Northern印迹法，将RNA固定在硝酸纤维素膜上后，用互补的，具有放射性标记的RNA或DNA探针与其杂交。此方法需要的试剂多，RNA质量要求高，不能检测低丰度mRNA，敏感性低，而且在测量同一样品不同mRNA丰度时显得笨拙。

核糖核酸酶保护分析法检测敏感性较Northern杂交高，可同时检测同一样品中不同丰度mRNA，但需要利用与靶mRNA恰好互补的反义核酸探针，这样如果实验产生易于被核糖核酸酶切割的RNA-RNA杂交时，将出现问题。

实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号来实时监测产物量的变化。主要类型有SYBR染料法、探针法和分子信号技术。

综上所述，现有技术的缺点是：成本高，效率底，耗时间等类似问题。目前最常规的方法包括Northern杂交、核糖核酸酶保护分析法等，但这些方法分别存在一些不足：Northern印迹需要的试剂多，RNA质量高，不能检测低丰度mRNA，敏感性低而且在测量同一样品不同mRNA丰度时显得笨拙；核糖核酸酶保护分析法检测敏感性较Northern杂交高，可同时检测同一样品中不同丰度mRNA，但需要利用与靶mRNA恰好互补的反义核酸探针，这样如果实验产生易于被核糖核酸酶切割的RNA-RNA杂交时，将出现问题。

发明内容

本发明提供一种实时荧光定量PCR检测花生LOX基因mRNA表达水平的方法。利用SYBR Green I实时定量PCR检测LOX基因mRNA表达水平，构建所要检测基因标准品后，可以对该基因扩增的起始模板的拷贝数进行精确的定量，还可以通过熔解曲线判断扩增产物的特异性，是一种灵敏度高、特异性好的检测技术。

实时荧光定量PCR检测花生LOX基因mRNA表达水平的方法，包括如下步骤：

(1)从花生组织中提取总RNA，反转录成cDNA，以所述cDNA为模板扩增获得LOX基因片段，将LOX基因片段与载体连接，构建重组质粒；

(2)将上述重组质粒转化感受态细胞，并从中提取含有目的基因(LOX基因)的重组质粒，计算重组质粒的拷贝数，将重组质粒稀释成不同倍数，即为实时荧光定量PCR反应的标准品模板；以所述的标准品模板进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线；

(3)提取被检测花生组织的总RNA，反转录成cDNA作为实时荧光定量PCR模板，以步骤(1)中相同的扩增引物进行实时荧光定量PCR，与标准曲线比较得出起始模板的拷贝数，确定被检测花生组织的mRNA表达水平。