[发明专利]一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法，可提高细胞移植后修复损伤组织的能力。

(二)背景技术

目前充血性心力衰竭发病率逐年升高，是65岁以上人群的首要住院原因，也是心血管疾病死亡的主要原因。细胞移植疗法可促进梗死局部血管新生和心肌再生，进而改善心肌梗死后的心功能，已成为目前心血管领域的研究热点。然而可供移植的细胞中胚胎心肌细胞增殖能力有限、取材不便，骨骼肌成肌细胞不能与心肌细胞形成缝隙连接且有致心律失常作用，导致该治疗手段止步不前。因此，以干细胞为种子资源的细胞治疗成为进行损伤组织修复和替代的重要手段。

成功建立干细胞治疗需要以下几大要素：具备自我更新，多向分化潜能以及免疫调节等特性的干细胞群体；来源广泛；移植后不发生并发症和肿瘤形成。间充质干细胞(MSC)是一类最早从成体骨髓中分离获得的多能性干细胞，具有分化为成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞等间质细胞的潜能以及免疫调节作用。由于其特有的生物学性状，它能作为细胞治疗的种子资源，参与治疗骨骼肌肉损伤，改善心血管疾病引发的心肌功能衰退，缓解移植物与宿主之间的免疫排斥现象。除了骨髓能作为MSC来源外，研究证实其还存在于如脂肪，子宫内膜，羊膜液，骨膜，脐带血等成体或胚胎组织中。然而目前所有用于临床试验的人骨髓MSC均在含动物源性的血清如胎牛血清或血清替代物的培养体系中培养扩增，使用这类种子资源进行细胞治疗可能会导致各种异源污染(如蛋白酶传染性因子，病毒和病原微生物)，也有可能引发异种抗原(如非人源唾液酸N-glycolylneuraminic acid和牛载脂蛋白B-100)导致的免疫反应。虽然已有研究试图采用自体或异体的血清或血浆代替胎牛血清来培养人骨髓MSC，但存在一定的局限性，首先供体能提供的自体血清或血浆有限，无法满足MSC扩增的需要；其次异体血清或血浆可能会导致MSC生长停滞或极速衰老。因此，优化干细胞培养体系将有助于提高其未来的临床应用价值。

(三)发明内容

本发明目的是优化干细胞培养体系，提供一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法。

本发明采用的技术方案是：

一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法，所述方法包括：将传代稳定的间充质干细胞于无血清预处理培养基中，常规条件下培养4～5天，获得处理后的间充质干细胞；处理后的细胞可直接用于细胞移植；

所述无血清预处理培养基组成如下：

N2添加剂        终浓度为1×

B27添加剂       终浓度为1×

IGF             5～20ng/ml

PDGF或bFGF      5～20ng/ml

溶剂为低糖DMEM培养基或高糖DMEM培养基。

其中N2，B27添加剂为市购商品，其成分确定且唯一，其终浓度为1×，意思是其中各组分在预处理培养基的终浓度与1×N2和1×B27中相同。N2，B27是美国Invitrogen公司生产的细胞培养基添加成分，用于作为神经干细胞培养基的添加成分，2006美国PNAS杂志报道在DMEM/F12培养基中添加1×N2和1×B27，并辅助添加bFGF能长期维持人胚胎干细胞的自我更新和定向分化潜能，但尚未有文献证实这类添加成分能维持组织来源的MSC的增殖和保持细胞形态。市购商品多为50×或100×母液，按比例(1/50体积或1/100体积)添加使其终浓度为1×即可。50×N2母液主要包含1mM人源转铁蛋白，8.61μM重组人胰岛素，1mM孕酮，1mM四甲烯二胺和1mM亚硒酸。B27主要包含D-生物素，牛血清白蛋白(BSA fraction V，无脂肪酸)，过氧化氢酶，L-肉碱盐酸，皮质酮，乙醇胺盐酸，D-半乳糖，谷胱甘肽，人重组胰岛素，亚麻酸，孕酮，亚硒酸钠，过氧化物歧化酶，白蛋白，维生素E和人源转铁蛋白。

本发明的要点在于利用N2，B27完全代替常规细胞培养基中的FBS，并辅助添加不同组合的细胞因子(IGF/PDGF或IGF/bFGF组合)，培养后能增加MSC基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达和分泌，一定程度提高细胞的运动能力。

所述培养在常规条件下进行，具体于37℃下、在CO₂体积浓度5％、空气体积浓度95％的混合气体中进行。

具体的，所述方法如下：将继代第8～11代的间充质干细胞于无血清预处理培养基中，于37℃下、在CO₂体积浓度5％、空气体积浓度95％的混合气体中培养4～5天，获得处理后的间充质干细胞；所述无血清预处理培养基组成如下：

N2添加剂     终浓度为1×