[发明专利]松口蘑培养物基因组的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于应用微生物学、分子生物学技术领域，具体涉及一种松口蘑培养物基因组的制备方法。

背景技术

松口蘑(Tricholoma matsutake)又名松茸，是一种与植物共生的真菌，其子实体是具有食药用价值的昂贵蘑菇，目前国际上尚不能人工栽培。我国东北长白山区、西南横断山区野生的松口蘑主要供出口，每年为国家赚回近百亿美元。为了保护利用这一珍稀的自然资源，迫切需要解读松口蘑的基因组，发展松口蘑培养物基因组的制备方法。

由于松口蘑子实体珍稀昂贵，研究材料针对松口蘑的纯培养菌丝体，而松口蘑培养物属于难培养微生物，其生长速度异常缓慢，在优选培养基上培养2个月，其菌落直径不到1cm，菌体生物量太少，常规丝状菌制备基因组的方法不适用松口蘑。

制备基因组的技术操作单元主要是细胞裂解、萃取、过滤、沉淀，其中生物化学的萃取、过滤、沉淀技术已经成熟，但细胞裂解因应用微生物种类不同必须采用适宜的独特技术，国内外迄今发表的研究文献都是围绕该技术进行发明创造。检索国内外迄今发表的研究文献，细胞裂解技术包括：

1、机械法，主要是各种液氮研磨、室温研磨、玻璃珠研磨等手段，缺点是操作繁琐，操作中生物量有损失，得率低，不安全，基因组降解，产品质量不稳定。

2、化学法，采用氯化苄、各类溶菌酶消化，缺点是特异性差，成本高，适用范围狭窄。

3、物理法，报道了应用超声波、微波、电钻、煮沸等方法，缺点是操作繁琐，不安全，基因组降解，产品质量不稳定，生物活性丧失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种松口蘑培养物基因组的制备方法，该方法得率高，制备的松口蘑培养物基因组的质量完整、纯度高。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：松口蘑培养物基因组的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

1)从松口蘑子实体中分离纯种菌丝体培养物，得到松口蘑的菌丝体培养物；

2)保护缓冲液的配制：50mmol/L Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl缓冲液的pH为8.0)；50mmol/L乙二胺四乙酸钠(EDTA的中文名：乙二胺四乙酸钠，EDTA的pH为8.0)；1.4mol/LNaCl；4wt％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB的中文名：十六烷基三甲基溴化铵)；

3)取松口蘑的菌丝体培养物浸没于保护缓冲液中，震荡、液氮冷冻、水浴，重复上述震荡、液氮冷冻、水浴过程1～3次；得到松口蘑的菌丝体培养物的裂解液；

4)按松口蘑的菌丝体培养物的裂解液与氯仿/异戊醇的体积比为1∶1，选取松口蘑的菌丝体培养物的裂解液、氯仿/异戊醇；其中氯仿/异戊醇由氯仿和异戊醇组成，氯仿与异戊醇的体积比为24∶1；

用氯仿/异戊醇萃取松口蘑的菌丝体培养物的裂解液中的松口蘑培养物基因组，离心，收集上清液；

5)以与上清液等体积的异丙醇对上清液进行沉淀，离心，得到沉淀物；沉淀物用乙醇洗后风干，溶于TE缓冲液，置-20℃下保存，得到松口蘑培养物基因组。

步骤3)所述的松口蘑的菌丝体培养物与保护缓冲液的配比为10mg∶500μL。

步骤3)所述的震荡、液氮冷冻、水浴为：震荡10s，液氮冷冻10s，70℃水浴30s。

步骤4)所述的萃取时间为30s，离心为：13000g离心1min。

步骤5)所述的离心为：4000g离心1min。

步骤5)所述的TE缓冲液的用量为：按松口蘑的菌丝体培养物与TE缓冲液的配比为10mg∶50μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明先保护缓冲液对样品进行预保护，避免基因组降解；然后采用低温快速冻结与常温快速融化交替1～3次，引起微量培养物细胞完美裂解，所得松口蘑培养物基因组的质量完整，生物活性保持。

2、低温快速冻结，不需手工操作，安全；抑制降解酶，保持生物活性；

3、常温快速融化，常规设备，成本低廉，方便安全；

4、用料微量，步骤少，耗时短，效率高；

5、对松口蘑微量培养菌体，没有操作损失，得率高，可收获足量高分子质量的基因组，10mg培养物可制备浓度在30-50μg/mL的产品，满足100次以上的PCR实验用量；

6、纯度高。

主要用途：广泛适用于各种分子生物学实验与遗传操作，可以解读松茸基因组信息、制备分子条码，进行染色体解组等分子育种，驯化栽培松茸，开发生物技术药物。

具体实施方式