[发明专利]一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47

说明书

技术领域

本发明涉及一种可溶性蛋白，它是由人SIRPα的配体CD47的胞外段，和氨基末端融合的TrxHis表达标签组成的一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，属于医药技术领域。 

背景技术

CD47又叫整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP)，最初从人胎盘与整合素αVβ3共纯化及从血小板与β3整合素共免疫沉淀而为人们所认识，其功能与整合素相关，因此称其为IAP[1]。CD47是一种广泛表达的抗原，存在于所有组织的不同细胞上。它是一个50kD的膜糖蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。其胞外段即N端为以IgV样结构域，之后为高度疏水的五次跨膜区，胞浆区即C端为3～36氨基酸长度的四种不同的剪切体。CD47最初是作为整合素依赖的白细胞对细胞外基质蛋白反应的调节分子来发挥作用的，但除此之外，CD47还有许多其他的重要功能。红细胞及机体其他正常细胞上的CD47与巨噬细胞上的SIRPα结合可调节巨噬细胞的靶向清除作用，从而组织巨噬细胞对正常细胞的吞噬作用。CD47与血小板上的αIIbβ或αVβ3，黑素瘤细胞和卵巢肿瘤细胞上的αVβ3平滑肌细胞和血小板上的α2β1之间存在相对稳定的交互作用，促进血小板活化、聚集，肿瘤细胞和平滑肌细胞的趋化与扩散。CD47同时也是细胞外基质蛋白血小板反应素(thrombospondin，TSP)的受体，CD47与单克隆抗体及血小板反映素的结合可诱导半胱天冬酶依赖的凋亡作用。CD47是T细胞活化的共刺激因子，活化凋亡过程，诱导T细胞无反应性。CD47作为SIRPα的胞外配体，在巨噬细胞对肿瘤细胞的清除过程中发挥这重要作用。 

信号调节蛋白α(SIRPα)是免疫球蛋白超家族成员，胞外区为三个免疫球蛋白样结构域；胞浆区是酪氨酸磷酸化结合位点。CD47通过与巨噬细胞上SIRP-a的相互作用，使SIRPa上的ITIM基序磷酸化，募集包含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶至胞膜，抑制细胞表面肌球蛋白的聚集，从而抑制吞噬作用。包含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶包括SHP-1和SHP-2，均是非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，SHP-1主要表达在造血细胞上，逆向调节许多细胞功能；SHP-2表达广泛，调节小GTP结合蛋白Ras，Rho的功能，正向 调节细胞功能。最早确定CD47在调节吞噬中的作用的证据是来源于CD47缺陷的小鼠的RBC移植入野生鼠体内后被迅速清除，RBC表面的CD47与巨噬细胞表面的SIRP-a结合，传递抑制信号，与巨噬细胞表面受体与吞噬性配体结合产生的吞噬性信号相冲突，使红细胞不被吞噬。 

有研究表明，对于白血病来说，巨噬细胞的吞噬作用是肿瘤免疫监视的重要调节因素，髓系，淋巴系白血病细胞及白血病干细胞上CD47表达上调，可通过与SIRPa间的相互作用，阻止白血病细胞被宿主的先天免疫系统清除。这也是白血病耐药、复发的重要原因之一。通过单克隆抗体阻断CD47/SIRPα间的作用，可以促进巨噬细胞对白血病细胞及白血病干细胞的吞噬作用，对于白血病的治疗有着重要的治疗意义。 

本发明基于CD47在调节吞噬中的重要作用，表达了可溶性的CD47的胞外段蛋白，与白血病细胞上CD47竞争结合巨噬细胞上的SIRPα，从而促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用 

发明内容

本发明的目的是提供一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，该蛋白可以结合于巨噬细胞细胞表面，有效地增强巨噬细胞对白血病细胞及白血病干细胞的吞噬作用。 

本发明的技术方案是：一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其特征是：它是由人CD47蛋白胞外段和融合的TrxHis表达标签组成；其中hCD47蛋白胞外段是hCD47第1-142位氨基酸。 

所述的hCD47第1-142位氨基酸包含负责与SIRPα受体结合的IgV样结构域；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是No1，并由No2的核酸序列编码： 

所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列编码： 

所述氨基末端融合的TrxHis表达标签，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列编码： 

所述白血病干细胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hCD47是在大肠杆菌BL21中用低温诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hCD47蛋白。