[发明专利]一种抗菌蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种抗菌蛋白，具有序列表中序列1或序列15所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的抗菌蛋白的基因，具有序列表中序列2所示的核苷酸序列或依照遗传密码简并性而衍生于序列2所示的核苷酸序列。

3.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的编码权利要求1所述的抗菌蛋白的基因。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，它是在表达载体的多克隆位点中插入了权利要求2所述的基因，在所插入的权利要求2所述基因的5’端加入了酶切位点和甲硫氨酸密码子，在所插入的权利要求2所述基因的3’端加入了终止密码子和酶切位点。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体是pPIC9K质粒。

6.表达权利要求1所述抗菌蛋白的pPIC9K重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)DNA聚合酶进行延伸反应：反应条件为：序列表中序列3所示的引物P1和序列表中序列4所示的引物R1(10μmol/L)各5μL，2×pfu PCR MasterMix 10μL，94℃变性3min，72℃延伸10min，得到DNA产物；

(2)PCR(聚合酶链反应)扩增DNA片段：PCR反应条件为：上述步骤(1)中的DNA产物1μL，序列表中序列5所示的引物P2(10μmol/L)和序列表中序列6所示的引物R2(10μmol/L)各1μL，2×pfu PCR MasterMix 10μL，超纯水7μL，94℃变性3min后，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min，得到扩增的DNA产物；

(3)用上述步骤(2)的DNA产物1μL，序列表中序列7所示的引物P3(10μmol/L)和序列表中序列8所示的引物R3(10μmol/L)各1μL，PCR条件与上述步骤(2)相同，得到进一步扩增的DNA产物；

(4)用上述步骤(3)中的DNA产物1μL，序列表中序列9所示的引物P4(10μmol/L)和序列表中序列10所示的引物R4(10μmol/L)各1μL，PCR条件与上述步骤(2)相同，合成得到具有序列表中序列11所示序列的含有本发明抗菌蛋白基因的DNA产物；

(5)上述步骤(4)中的DNA产物用EcoRI酶切，pPIC9K质粒用EcoRI酶切并用CIAP碱性磷酸酶去磷酸化，电泳并回收酶切后的DNA产物和pPIC9K，经T4DNA连接酶16℃连接4h，得到的混合溶液体系中，含有正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒和反向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒；

(6)将上述步骤(5)中含有混合重组质粒的溶液体系转化感受态大肠杆菌TOP10菌株，在含氨苄青霉素抗性的LB培养基上挑选单菌落，扩大培养后提取质粒；

(7)用序列表中序列12所示的引物α-Factor和序列表中序列10所示的引物R4，利用PCR方法筛选正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒，PCR反应条件是：以1μL上述步骤(6)中的质粒作为模板，α-Factor和R4(10μmol/L)引物各1μL，2×PCRMasterMix10μL，超纯水7μL，94℃变性3min，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min；经电泳检测，将能扩增出约370bp片段的质粒进一步进行EcoRI酶切鉴定；酶切后的质粒经电泳检测，将得到约290bp酶切片段的质粒进行DNA序列测定，在EcoRI酶切位点上正向插入了序列表中序列2的质粒，即为表达本发明抗菌蛋白的pPIC9K重组质粒。

7.一种制备权利要求1所述的抗菌蛋白的方法，其特征在于：用SalI酶切以权利要求6所述方法构建的pPIC9K重组质粒，电泳回收线性化的pPIC9K重组质粒，用电转化法将回收的线性化的pPIC9K重组质粒转入毕赤酵母中，将转入了pPIC9K重组质粒的毕赤酵母菌株接种到适合的培养基，在适合的条件下培养诱导抗菌蛋白基因表达，离心收集培养基上清液，经纯化得到本发明抗菌蛋白。