[发明专利]斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，可用于科研、疾病诊断和食品安全领域。

背景技术

金标免疫检测技术是继同位素、荧光素和酶标记技术之后的一种新型免疫标记技术。该方法简便、快捷、不需要特殊设备，结果判定有极好的可视性。适用于‘床边’检测、疾病普查和流行病监测，以及海关、食品安全和养殖业等领域。

常用的金标免疫检测包括侧向免疫金层析法（Bilateral immune-chromatographic assay）和斑点金免疫渗滤法(Dot immune-gold filtration assay)。侧向免疫金层析法是受测样本和胶体金标记探针在一种微孔膜（例如：硝酸纤维素膜）上受虹吸作用做侧向运动，与预先包被在膜另一端的捕获探针相遇而聚集，呈现肉眼可见的红色线条。由于受测样本和标记探针是在混合状态下做同步运动，这种方法在检测抗体时会因为待测样本中的非特异性抗体存在而消耗标记探针，从而降低检测的灵敏度。在这种情况下通常使用双抗原夹心法取代间接抗体法。但双抗原夹心法要求包被抗原与标记抗原的抗原决定簇有尽可能大的差异而避免竞争性抑制，从而对试剂质量和成本提出更高的要求，成为该技术的主要缺陷。竞争法则以不显色为阳性结果，在很多情况下给结果判定带来不便。所以，目前该技术的临床应用受到局限。

斑点免疫金渗滤法是让待测样本垂直渗滤过微孔膜（例如：硝酸纤维素膜），被膜上包被的捕获探针捕获，再以同样方式让胶体金标探针渗滤过微孔膜，与被捕获的配体结合后聚集形成肉眼可见的红色斑点。这种方法的缺陷是大部分待测样本和标记探针从斑点以外的非相关区域流失，影响检测灵敏度，致使该技术尚未在临床检验中广泛使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高灵敏度和高准确度的斑点免疫金定向渗滤检测试剂盒，以克服现有技术的不足。

本发明的另一目的是提供斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒在科研、疾病诊断和食品安全领域中的应用。

本发明的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒包括斑点免疫金渗滤卡片，纳米胶体金或乳胶微球标记的检测探针，阴性和阳性标准品以及冲洗液，其工作原理是：在传统斑点免疫金渗滤法的基础上，在微孔膜与吸水膜之间设置一个渗滤限制装置，使待测样本和胶体金标探针依次沿着包被探针所覆盖的区域渗滤，避免试剂在其它非相关区域的流失，以提高检测灵敏度。

本发明实现过程如下：

一种斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，包括斑点免疫金渗滤卡片，纳米胶体金或乳胶微球标记的检测探针，阴性和阳性标准品以及冲洗液，其特征在于该斑点免疫金渗滤卡片为斑点免疫金定向渗滤卡片，其能够使待测样本和胶体金标探针依次沿着包被探针覆盖的区域渗滤。

所述的斑点免疫金定向渗滤卡片有以下两种实现方式，可以使待测样本和胶体金标探针依次沿着包被探针覆盖的区域渗滤。其中一种实现方式是在传统斑点免疫金渗滤法的基础上，在具有微孔和层析作用的微孔膜与吸水垫之间设置渗滤限制层，使待测样本和金标探针通过微孔膜时先向膜中央聚集，然后通过膜中央的探针包被区垂直渗滤至吸水垫，从而降低试剂在其它非相关区域里的流失，提高检测灵敏度。这种斑点免疫金定向渗滤卡片从上到下由表层、微孔膜、渗滤限制层和吸水垫4层组成，表层为非吸水材料，中央有一开孔；微孔膜为一种与蛋白分子有亲和力的微孔膜（孔径为0.2-5μm的硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜或PVDF膜），其上至少包被一种探针；渗滤限制层为非吸水材料（非吸水高分子薄膜、双面胶或防水涂料），中央有一开孔。

另一种实现方式是从上到下由表层、微孔膜和吸水垫3层组成，表层为非吸水材料，中央有一开孔；微孔膜为一种与蛋白分子有亲和力的微孔膜（孔径为0.2-5μm的硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜或PVDF膜），微孔膜上至少包被一种探针；吸水垫中央设置有凹槽，凹槽的中心设置有与包被探针形状大小相匹配的突起，探针包被区域与吸水垫突起部分紧密接触，微孔膜其余部分与吸水垫非接触，也就是微孔膜的其余部分与吸水垫相对应的凹槽悬空隔离。

使用微量点样或喷涂技术，将1-2μl捕获探针（1mg/ml）在微孔膜中央固定成直径为2～3mm的圆形斑点或2×10mm²的条形，常温或37℃吹风干燥，用1%牛血清白蛋白、小牛血清或脱脂牛奶浸泡微孔膜，以封闭膜上的空白结合点，常温或37℃吹风干燥。

所述的斑点免疫金定向渗滤卡片表层开孔为圆形或椭圆形，开孔直径8～12mm。

所述的斑点免疫金定向渗滤法卡片表层为PVC、PE、PP、PS、ABS塑料、或其它非吸水高分子材料。