[发明专利]酶法检测5’核苷酸酶试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及生物试剂，具体涉及一种酶法检测5’核苷酸酶试剂盒。

背景技术：

5’-核苷酸酶(5’Nueleotidme，5’一NT是一种糖蛋白，由两个分子量为7000的亚基组成。5’一NT的主要功能是参与核酸的分解代谢，并广泛存在于肝脏和各种组织中。当血清中此酶升高时，常见于肝脏系统疾病，如原发性和转移性肝癌，慢性肝炎，肝硬化，病毒性肝炎，梗阻性黄疸胆结石.胆囊炎等。5-NT的增高可达2～6倍，且与病情严重程度呈正比例关系。因此，5’一NT是诊断肝肿瘤及消化道肿瘤及消化道恶性肿瘤非常灵敏的酶学指标。在病变早期，当肝功能、肝扫描和有关肝病检查阴性时，该酶活性已明显增高。对于AFP(甲胎蛋白)阴性病例，其与AFP互补诊断肝癌的阳性率可达94％。另外，5’一NT特异性高，ALP在肝胆系统疾病和骨骼系统疾病时均可增高。5’一NT除肝胆系统疾病增高外，骨骼系统疾病一般均不升高。还可用于鉴别诊断肝细胞性黄疸和阻塞性黄疸，后者5’一NT明显高于前者，以及发生胆汁淤积的高于未发生胆汁淤积的患者。

5’-NT用于其它方面的检测如：

有助于检测肺癌疾病。5’-NT活性变化与肺癌肿瘤细胞生长、发展和转归密切相关，是肺癌核苷酸代谢中重要的转化相关酶，监测其改变既可作为肿瘤恶变和衡量分化程度的指标，又是肿瘤生长的分子基础。因此可根据其增高不同程度来鉴别肺部良性与恶性疾患，由于当肿瘤并发肝、胆系统疾患时，5’-NT也可明显升高，故需结合病史进行分析和区别。但如与肺癌的血清肿瘤标志物联检以互补诊断，对发现肺癌有一定的辅助诊断作用，且方法简便、快速、准确。

有助于检测冠状动脉病变疾病。血清5’-核苷酸酶升高可能在冠心病发生发展中起到一定的保护作用，对此进行干预，如使用ATP制剂、腺苷、α1受体激动剂等有可能提高5’-核苷酸酶的含量及活性，可能对心血管事件的发生起到预防作用。

由于血清5′-NT测定对肝胆及多种疾病的诊断有较好的特异性和灵敏度，5’-NT已作为肝功能常规项目检查进入临床，将能使临床医生更全面地了解患者肝脏情况，提高其临床应用价值。在近20年中，测定方法得到不断开发和改进，先后发展了检测方法和相应的检测试剂，如：测磷比色法，其原理为5’-NT将次黄苷-5′-单磷酸盐(5′-IMP)脱氨产生次黄苷(Inosine)和磷酸(Pi)，后者与钼酸铵作用生成磷钼酸，再被还原剂还原成钼蓝，颜色深浅与释放的磷酸成正比。但测磷比色法试剂种类多，操作繁琐、费时，不适宜自动化分析，而且血清中ALP也能水解5’-磷酸腺苷生成相同的产物，反应过程中需加入Ni2+离子抑制ALP的非特异性反应，否则会影响测定结果的准确性。另一种方法为5’-NT催化5′-IMP水解，产生次黄嘌呤核苷和氨。然后用Berthelot色反应(1859)测定反应过程中产生氨的量，从而计算血清5’-NT活性单位，所需试剂易配制，仪器简单，但灵敏度低，易受外源性NH3影响，空白过高。5’-NT偶联谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase，GLDH)法因血清含氨干扰，以及测试系统中过高NADH造成非特异性氧化而无法计算。又如5’-NT测试法：Kalckar氏应用5’-NT偶联，嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleosidephosphorylase，PNP)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)过氧化物酶(PEROXIDASE，PEO)；反应连续监测法：通过测量293nm处尿酸盐吸光度上升的速度来测算5’-NT活性，但是，293nm时血清吸光度太高，造成临床应用不便。酶法测定5’-NT简便快捷、结果可靠，对肝胆疾患的诊断具有较高应用价值。酶法原理：

5’-IMP+H₂O5-NT＞次黄苷+NH₄⁺

次黄苷+Pi PNP＞次黄嘌呤+核糖-1-磷酸

次黄嘌呤XOD＞尿酸+H₂O₂

H₂O₂+4-AAP+EHSPT POD＞红色醌衍生物+H₂O

但是目前这种试剂的检测方法并不完善，一是PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)试剂价格昂贵，使用价格高，二是PNP试剂不稳定。

发明内容：