[发明专利]肠激酶轻链基因的合成及其表达产物的制备方法

权利要求书

1.根据毕赤酵母密码子偏好性优化的牛肠激酶轻链基因序列，为序列表中序列3。

2.按照权利要求1所述的基因，所用表达载体为pPICZαA，构建表达载体时在5’端加入Xho I位点，在Xho I位点和牛肠激酶轻链基因序列间加入KEX2蛋白酶酶切位点Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，在3’端加入TGA终止密码子以及Not I位点，将DNA片段和pPICZαA载体经Xho I与Not I双酶切、电泳回收、连接、电转至宿主菌。

3.根据权利要求2所述，其特征在于：构建的表达载体宿主菌为毕赤酵母，优选为毕赤酵母GS115stab或者X-33。

4.一种发酵制备牛肠激酶轻链蛋白的方法，其特征在于：所述编码基因电转至毕赤酵母菌发酵表达的优选方法为：16L发酵罐体系中，30℃，pH4.0-6.0，更优的为pH5.0，在基础培养基中培养16-18h后，按2.5ml/min流加50％甘油约600ml，饥饿0.2～0.3h，菌体湿重为180-200g/L时开始诱导，优化的诱导pH为4.0-5.0，最优诱导pH为4.0，前12h诱导期内共流加入10-20g甲醇，稳定诱导期内按2ml/min加入含有1％体积PTM1的甲醇诱导60-72h，每12h加入5g大豆蛋白胨或酸水解酪蛋白；所述基础培养基为：甘油40g/L，K₂SO₄17.5g/L，MgSO₄ 14g/L，KOH 3.2g/L，CaSO₄0.8g/L，PTM 13ml/L。

5.一种牛肠激酶轻链蛋白的纯化方法，其特征在于：发酵上清经PALL CentramateTM超滤系统置换缓冲液，置换溶液为：20-50mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH 7.5-8.5，NaCl浓度为0-50mM，膜包选择为5K分子量，面积为0.1m²；超滤后的溶液经A液(缓冲液)：20-50mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH 7.5-8.5，NaCl浓度为0-50mM平衡过的阴离子层析填料(并不仅限于Q FF或Capto Q)，B液：50-100mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH7.5-8.5，NaCl浓度为100-500mM，洗脱5-10个柱体积；洗脱溶液经20-50mM Tris-HCl0-150mM NaCl 0-10mM CaCl₂pH7.5-8.5平衡过的Trypsin Inhibitor agarose(Sigma)或者trypsin-Sepharose 4B(GE)层析柱料，B液：50-200mM HAc-NaAc或甲酸-甲酸钠、1-10mMCaCl₂、pH3.0-4.0洗脱5-10个柱体积；成品置换入20mM Tris-HCl(pH7.4)、50mM NaCl、2mM CaCl₂缓冲液中，分装保存。