[发明专利]一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种简便分离纯化重组人血清白蛋白(rHSA)的方法。经纯化后的rHSA具有高纯度和极低多糖含量，解决了制约人血清白蛋白分离纯化中分离步骤繁琐、多糖等杂质含量高的问题。

技术背景

人血清白蛋白(HSA)是人血中最丰富的蛋白，其作用为维持血液渗透压，结合以及运输营养物质。HSA一方面可作为临床药物，治疗因白蛋白损失、合成障碍、创伤失血引起的白蛋白含量下降。另一方面，可作为细胞培养的添加成分、药物的辅剂、赋形剂等，具有广泛的应用价值。

HSA主要有两种方式，一是从血液中提取，称为pHSA，目前广泛使用的冷乙醇沉淀法及硫酸铵、利凡诺、辛酸盐沉淀法都可用于从血液中分离纯化pHSA。因为HSA需求量大，目前存在着血液来源有限，不能满足需求的问题。二是利用基因重组技术，构建高效表达HSA的基因工程菌或重组细胞进行rHSA的生产，该方法解决了pHSA来源不足的问题，具有很好的应用前景。但rHSA发酵液，如来源于酵母菌的发酵液，组成复杂，含有蛋白酶、杂蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖等杂质，其中蛋白酶易使rHSA变性、降解。多糖包括甘露聚糖、葡聚糖及糖蛋白等复合物，是引起过敏的抗原性物质，必须采用多步层析方法才能将其去除。

rHSA的分离已经有许多报道，常见的分离过程包括：rHSA的发酵液去除菌体和细胞后进行两步超滤、对上清液进行加热处理灭活蛋白酶，再进行阳离子交换层析、加热处理除色素、疏水层析、阴离子交换层析等初级的纯化过程，再经过鳌合树脂、硼酸或硼酸盐处理等进一步的纯化过程，得到稳定的、高纯度的rHSA(专利US5986062，专利CN1854155A)。也可以将过滤或者离心的rHSA上清液进行阳离子交换层析，然后使用蓝琼脂糖亲和层析介质，去除45kDa的降解片段和酵母抗原，再使用凝胶过滤层析、阴离子层析等纯化步骤，得到高纯度的rHSA(专利WO9731947)。专利CN100463921C公开了一种可耐受高盐型的阳离子交换介质，可以直接吸附发酵上清液中的rHSA，不需要将发酵上清液进行稀释处理，然后再经过疏水层析、阴离子交换等纯化步骤得到高纯度rHSA。

上述方法虽然能够得到高纯度的rHSA，但一般均需采用多步柱层析，操作复杂、处理时间长、成本高、收率低。一般采用阳离子交换层析介质以吸附方式捕获发酵液或发酵上清液中的rHSA，而绝大多数阳离子层析介质不能耐受高浓度盐，吸附时样品一般需要稀释，专利CN100463921C公开了不需对发酵上清液稀释的阳离子交换介质，但是该介质尚未商品化，影响其推广应用。从阳离子交换层析中洗脱的含有rHSA的溶液，一般采用流穿的方式进行疏水层析(专利US5986062，专利CN1854155A)，即在选用的层析条件下，rHSA不和疏水介质结合，疏水层析介质只吸附rHSA溶液中的杂蛋白、多糖等杂质。该方式去除多糖等杂质的能力有限，必须结合其他柱层析方法，如阳离子交换层析、阴离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等才能够使多糖含量达到一个较低的水平。目前尚未见使用少于3步柱层析的方法得到高纯度、低多糖含量的rHSA的报道。

另一方面，因为酵母及重组酵母的发酵液中均含有蛋白酶，这些蛋白酶对rHSA有比较强的降解作用，如不及时灭活将影响rHSA的收率，特别是目前普遍采用的阳离子交换层析中，因为在酸性条件下上样，蛋白酶对纯度和收率的影响更加显著。(Yeast，1996，12：1～16；生物技术通讯，2006，176：908-910)。专利US6617133对含rHSA溶液的稳定性进行了研究，不经过加热灭活蛋白酶处理的rHSA发酵上清液，在pH 6.0、室温下静置2小时后，蛋白回收率仅为80％。该发明公开了一种提高rHSA溶液稳定性的方法，即对发酵液或发酵上清液68℃下加热处理30min后，再通过扩张床等技术利用阳离子交换介质，直接从发酵液中提取rHSA。该方法能够有效地提高rHSA溶液的稳定性，但需对发酵液或发酵上清液进行加热处理，发酵液或发酵上清液体积大，操作复杂，能耗高，对rHSA的收率也有一定的影响。