[发明专利]一种利用细胞工厂生产鸡马立克氏病疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种生产鸡马立克氏病液氮苗(814株)的方法，尤其是公开了一种利用细胞工厂制备鸡马立克氏病液氮疫苗(814株)的方法。

背景技术

鸡马立克病是由细胞结合性疱疹病毒(MDV)引起的鸡的一种高度传染的淋巴组织增生性疾病，鸡群感染马立克病毒后危害较大，对养禽业造成严重的危害。随着疫苗的广泛应用和鸡品系的不断选育，MDV在自然选择和免疫压力的双重作用下，其毒力不断增强，一次次地突破了疫苗所能提供的保护力。

20世纪70年代所分离到的为标准强毒(VMDV)，70年代末到80年代MDV发生了很大变化，毒力增强，成为超强毒；90年代出现了更强的超强毒(VV+MDV)。因此HVT冻干苗对MD强毒和VV+MDV免疫效果差，可以说血清III型HVT疫苗的历史使命基本完成。

目前，普遍使用的能够抵御超强毒和超超强毒的疫苗毒株主要有814株和CVI988。814株是我国哈尔滨兽医生物药品研究所的童昆周先生从没有免疫过马立克疫苗的健康鸡群分离出的一株没有致瘤性的马立克病毒，与CVI988同属于血清I型毒株。但814株属于自然弱毒株，无致瘤性，是我国惟一没有致瘤性的血清I型疫苗株，因此，不存在毒力返强的问题。本毒株遗传性能好，具有良好的免疫原性，不受母源抗体影响。

传统的病毒性疫苗制备，关键是为病毒提供适宜其增殖的细胞基质，通常采用贴壁培养的生长方式。贴壁培养系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。转瓶培养是小量培养到大规模培养的过度方式，或作为生物反应器接种细胞的准备途径。转瓶培养是目前国内疫苗生产厂家普遍采用的细胞培养方式，具有结构简单、投资少、技术成熟、重复性好、容易扩大等优点，同时也存在着细胞生长密度低、转瓶间细胞生长差异大、劳动强度大、占用空间大、能耗高、水耗量大等缺点。

发明内容

本发明提供一种利用细胞工厂生产的鸡马立克氏病液氮疫苗，包括如下组分：

每支成品(2mL)含以下组分及含量：

199综合营养液： 1.4～1.7mL

犊牛血清：      0.2～0.4mL

冷冻保护液：    0.1～0.2mL

病毒量：所含病毒蚀斑数不低于6×10⁶PFU的马立克氏病814株病毒。

其中所述的199综合营养液购自美国Invitrogen公司。

本发明还提供制备上述疫苗的方法，包括如下步骤：

1)、制备鸡成纤维细胞悬浮液：

选择9-10日龄发育良好的无特定病原体(SPF)鸡胚，先用4％碘酒消毒气室部位，用75％酒精脱碘，无菌取出鸡胚，用Hank’s液洗涤胚体，用无菌剪刀将胚体剪成米粒大小的组织块，用Hank’s液洗涤3次后；按每个鸡胚4～6mL的比例加入0.25％的胰酶(DE)，在38℃消化20～30min后，弃去胰酶，用Hank’s液洗涤3次；加入营养液，分散细胞，静置后用10～15层纱布过滤，再次加入乳汉液，反复分散细胞，确认组织块被分散成单个细胞，制成每一毫升含活细胞数80～120万的鸡成纤维细胞悬浮液，混合均匀后备用；

2)接种及更换维持液：

往制备的鸡成纤维细胞悬浮液中加入工作毒种，分装在细胞工厂中，每层150～250mL，盖好进液口盖，放38℃的温室内静置培养。培养24～36h后弃去细胞生长液，加入含有2～5％血清的199营养液，将营养液分匀拧紧瓶口帽，放入38℃温室培养；或者将制备的鸡胚成纤维细胞悬浮液分装在细胞工厂中，每层150～250mL，盖好进液口盖，放38℃的温室内静置培养。培养24～36h后弃去细胞生长液，加入含有工作毒种的199营养液，将营养液分匀拧紧瓶口帽，放入38℃温室培养48～72h；

其中，优选的是，每平方厘米细胞工厂的平面上接种5-10万个鸡胚成纤维细胞。

3)收获：

培养至80％以上的细胞出现致细胞病变效应(CPE)时，即可收获，弃去营养液，加入EDTA-胰酶混合消化液250～350mL/层，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入199营养液300～400mL/层，停止消化。收集，无菌检验后，分至离心瓶中；

4)离心、提取细胞：

于2-8℃、1500r/min离心10～20分钟，离心后弃去上清，收集沉淀细胞；

5)配苗与分装：