[发明专利]一种检测活的非可培养状态副溶血性弧菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及致病性微生物副溶血性弧菌检测领域，特别是涉及一种检测活的非可培养状态副溶血性弧菌的方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，简称V.p)是广泛分布于近海区域、盐湖及海产品中的革兰氏阴性短杆嗜盐菌，能感染海水鱼类、对虾、蟹、甲壳类等多种水产动物，人食用了受该菌污染的海产品后，会出现食物中毒及腹泻等症状，是一种引起食源性疾病的重要病原菌。20世纪80年代初期，研究人员发现并提出了细菌“活的非可培养状态”(Viable but Non-Culturablestate，VBNC)，即细菌处于不良环境条件时，其细胞缩小成球形，用常规方法不能培养，但具有一定的代谢活性，用特殊方法可以证明其依然存在。当细菌处于VBNC状态时，经过一定的条件恢复后即可以复苏，经研究部分复苏菌株的毒力基因并未遭到破坏，故VBNC状态细菌对人类公共健康、食品的微生物检验、遗传工程细菌向环境释放等安全性问题仍然有潜在致病性，研究该状态及其检测方法有着重要的意义。

随着周围环境的改变副溶血性弧菌会转化为VBNC状态，由于在VBNC状态下这些细菌用常规方法(如传统的微生物培养基培养、普通PCR验证等)不可检出但仍保持活力，故经典活菌直接计数法(Direct viable count，DVC)、检测细胞内CTC水解情况判断代谢活性、检测细胞中INT的减少判断代谢活性、ELISA等方法已广泛应用于细菌VBNC的研究，但是其准确性、精密性以及时效性还有待提升。在确定微生物检测标准时，之前大多数研究为通过普通PCR验证可培养状态(Viable Culturable，VC)致病基因的活性，然而这对于VBNC状态显然是不合适的。

近些年逆转录聚合酶链反应技术(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)检测mRNA是一项很有前途的技术被应用于细菌的VBNC状态，用于评估VBNC状态细菌产生的影响。细菌mRNA的半衰期很短，这是由于核酸酶的存在会使其降解，所以mRNA的存在可以作为细胞存活最有力的也是最令人信服的判断标准。但是该方法却并未在副溶血性弧菌中应用，究其原因，及其可能是由于细菌处于VBNC状态其特异性管家基因不好确认引起。

由于RT-PCR法具有很高的特异性和敏感性，而且这项技术能够使我们确定细胞是否存活。虽然说其它方法的检测参数像蛋白质的合成能力，不可分裂细胞的延长指数等似乎同样有效，但比起RT-PCR法，这些方法不如其可靠且不能够很标准化的实际应用。因此RT-PCR技术作为一种分析基因表达的快速灵敏的方法在检测细菌VBNC状态已经显示出其重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、准确检测样品中是否存在活的非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌以及一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：

主要运用RT-PCR对副溶血性弧菌VBNC状态的rpoS基因进行检测。其中，特异性管家基因rpoS主要编码一种转录因子，该转录因子命名为sigmaS(σS)，主要调控细菌中的应激反应机制，被用来检测VBNC状态的副溶血性弧菌的活性，而副溶血性弧菌tl特异性基因则在VBNC状态则运用PCR/RT-PCR无法检出。

本发明第一方面，一种检测样品中是否存在活的非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌的方法，包括步骤：

以抽提自所述样品的总RNA为模板，用rpoS基因的特异性引物对进行逆转录聚合酶链反应，从而扩增出对应于rpoS基因的扩增产物；

检测所述的对应于rpoS基因的扩增产物的存在与否，如存在所述扩增产物则表示样品中存在VBNC状态的副溶血性弧菌(副溶血性弧菌VBNC状态中该特异性管家基因rpoS运用PCR法检测无活性)；如不存在所述扩增产物则表示样品中不存在VBNC状态的副溶血性弧菌。

其中所述的样品是经tl基因检测呈阴性的样品。

所述的样品可以是水产品。所述的水产品包括：海水鱼类、对虾、蟹、甲壳类等多种水产动物。

所述的特异性管家基因引物rpoS对选自下组：

上游5’-gac aat gcg tca gag acg-3’SEQ ID NO：1；

下游5’-tca cca cgc aat gct ctg-3’SEQ ID NO：2。

本发明另一方面，一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法，包括步骤：