[发明专利]一种利用红色荧光蛋白用做水稻转化筛选标记的转化方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种新的应用于植物转化的安全的筛选标记，并提供了利用荧光显微镜进行筛选的方法，属于生物技术领域。

背景技术

利用转基因技术能够将具有优良性状的目的基因导入植物基因组中，从而使植物的遗传性状得到改良。然而转化过程中只有少数植物细胞能够吸收外源DNA并整合进植物基因组中，大多数细胞是未转化的。因此，目的基因的引入常常需要借助于筛选标记基因，赋予转化细胞以特定的选择性标记，以便识别和鉴定转基因植物。

传统的鉴定分离转化细胞的方法大都是“负向筛选”，常用的筛选基因如抗生素标记NptⅡ基因（产生新霉素磷酸转移酶，抗卡那霉素、G418、巴龙霉素、新霉素）、HPT基因（产生潮霉素磷酸转移酶，抗潮霉素），抗除草剂基因Bar基因（产生PPT乙酰转移酶，抗Bialaphos或glufosinate）等，在添加了筛选剂的培养基上，转化细胞能够生长，而未转化细胞的生长则受到抑制甚至被杀死。

随着转基因产品的商业化，转基因的生物安全尤其是筛选标记的生物安全受到广泛关注。负向筛选标记基因的潜在危害在于：抗除草剂基因可能会导致超级杂草的产生；抗生素抗性基因可能会逃逸到环境中进行传播，也有可能通过食物在肠道中水平转移至微生物，从而影响抗生素治疗的有效性；另外一方面，非转化细胞在逐渐凋亡过程中能够分泌毒素或生长抑制剂，阻碍营养物质向转化细胞的运输，从而影响转化细胞的增殖及分化。

鉴于负向筛选基因的各种不利因素，正向选择方法应运而生。所谓正向筛选是相对于负向筛选而言的，即在筛选培养基上，转基因细胞能够有效利用培养基中的碳源正常生长，而非转化细胞不能利用培养基中的唯一碳源受到饥饿抑制。常用的正向筛选基因如糖代谢酶基因木糖异构酶基因（xylA），甘露糖磷酸异构酶（PMI）和氨基酸代谢酶如谷氨酸-1-半醛转氨酶基因（heml），这种筛选方法没有毒素物质，不影响转化细胞的生长和再生，而且很多报道表明正向筛选方法比负向筛选有着更高的筛选效率。但是，利用这些糖类做唯一碳源可能会对植物细胞的再生分化产生不同于蔗糖的效应，这些都还需要进一步的研究。

目前还有一些转化系统，先利用通常的选择标记筛选出初级转基因植株，然后利用转基因植株后代遗传重组使选择标记与目的基因分离，或利用位点特异酶将标记基因切除而培育出无选择标记的转基因植株。这类方法主要有三种系统：共转化系统、双T-DNA边界序列转化法、特异重组酶转化系统（FLP/ FRTs、Cre/LoxP、R/ RS 及GIN 系统等）和转座子系统等，其中应用最广泛的是共转化法和Cre/lox 位点特异性重组系统。然而这些筛选标记的剔除技术尚处于探索阶段，所用的载体大多局限于农杆菌的T-DNA载体，也主要在模式植物如烟草和拟南芥上研究的较为成熟，要使这些技术成功应用于植物育种，还需要大量的研究工作，并针对不同植物建立相应的标记基因剔除系统。例如，对于共转化法来说，标记基因和目的基因的遗传分离经过有性世代才能实现，这不仅会增加育种时间，而且无法应用于无性繁殖的植物品种。而Cre/lox系统应用的难点在于Cre重组酶启动的时间以及如何启动Cre 重组酶的表达进而消除lox 位点间的序列。其次，筛选标记的剔除法需要更高的效率以适应大规模生产应用。

另外一种安全的筛选标记是荧光蛋白。荧光的发生不需要任何底物和辅助因子，其表达产物也对细胞没有任何毒性，不会影响细胞的正常生长和功能。而且，利用荧光的强度可以分辨出转基因植物的纯合性以及杂合性。第一个广泛应用的荧光蛋白是绿色荧光蛋白（GFP），GFP用于植物转化中的筛选标记已经申请专利(US6486382, EP0904371B1)。但是绿色蛋白本身还是有很多缺点的，它的发射波普限制在440 ~ 529nm, 激发和发射波谱太短，能够激发细胞内某些物质发生荧光，造成细胞内荧光成像背景较高。

1999 年报道了第一个红色荧光蛋白drFP583(DsRed)，其优点显而易见：与GFP 系列荧光蛋白共用，且激发和发射波长更长，细胞内成像背景低，因此迅速被关注。短短数年，对红色荧光蛋白的一系列研究，不同野生型的红色荧光蛋白经过一些列体外进化，得到各种不同发射波长的突变体，发射光谱可以覆盖574nm到655nm，极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性，为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标签。然而，红色荧光蛋白作为转基因植物的筛选标记还没被报道过。