[发明专利]hHscFv-Rcr基因序列及转基因烟草的制备方法

权利要求书

1.一种hHscFv-Rcr氨基酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO.2所示。

2.一种hHscFv-Rcr核苷酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO.1中第56-1258位所示。

3.一种根据权利要求1所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征在于，包括如下的步骤：

第一步、构建含hHscFv-Rcr基因的表达载体：将含有融合基因hHscFv-Rcr的克隆载体质粒进行酶切，回收目标DNA片段，获得带有相应的粘性末端的目的基因hHscFv-Rcr，然后将其克隆到烟草表达载体中，通过测序或酶切鉴定，在确保表达载体中的目的基因阅读框架正确的前提下，再将表达载体质粒用冻融法导入农杆菌中，获得携带烟草表达载体的根癌农杆菌；

第二步、烟草遗传转化：将灭菌后的烟草种子播于发苗培养基上，取生长两周左右的无菌叶片，作为外植体用于转化；

第三步、hHscFv-Rcr功能蛋白提取。

4.根据权利要求3所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是，所述的第二步具体包括：

2.1)将含有目的基因表达载体的携带烟草表达载体的根癌农杆菌于28℃摇菌培养至OD₆₀₀＝0.8～1.0时，室温6,000rpm离心5～8分钟；

2.2)弃上清，菌体用液体MS培养基重悬，然后加入准备好的外植体浸泡8～10分钟；

2.3)将浸染结束后的外植体取出，吸去表面残余菌液；然后将外植体置于共培养培养基上在25℃共培养36小时；

2.4)共培养结束后将外植体转移到分化培养基上，在25～28℃光照下培养，培养7～15天可见愈伤组织的形成，约20天后可见分化芽长出；

2.5)待再生芽长至约3-4厘米时，将其切下移植到生根培养基上进行生根培养，7～10天左右生根；

2.6)形成完整根系后，将植株取出，用自来水洗去附着在根系上的固体培养基，在珍珠岩中驯化并用质量体积百分比为1％的MS粉水溶液补充营养和水分，一周后移入土中。

5.根据权利要求4所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是，所述的发苗培养基的组分及其质量百分比为：MS粉0.22％、蔗糖3％、烟草凝胶0.26％，余量为蒸馏水；该发苗培养基的pH值为5.8。

6.根据权利要求4所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是，所述的液体MS培养基的组分及其质量百分比为：MS粉0.44％、蔗糖为3％，余量为蒸馏水；该液体MS培养基的pH值为5.8。

7.根据权利要求4所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是，所述的共培养培养基的组分及其质量百分比为：MS粉0.44％、蔗糖3％、烟草凝胶0.26％、6-苄氨基嘌呤0.0001％、α-萘乙酸0.00001％，余量蒸馏水；该共培养培养基的pH值5.8。

8.根据权利要求4所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是，所述的分化培养基的组分及其质量百分比：MS粉0.44％、蔗糖3％、烟草凝胶0.26％、6-苄氨基嘌呤0.0001％、α-萘乙酸0.00001％、卡那霉素0.005％、羧苄青霉素0.025％，余量蒸馏水；该分化培养基的pH值5.8。

9.根据权利要求4所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是，所述的生根培养基的组分及其质量百分：MS粉0.44％、蔗糖3％、烟草凝胶0.26％、6-苄氨基嘌呤0.0001％、α-萘乙酸0.00001％、卡那霉素0.005％、羧苄青霉素0.025％，余量蒸馏水；该生根培养基的pH值5.8。