[发明专利]一种与人血清白蛋白结合的七肽与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种与人血清白蛋白结合的七肽与应用。

背景技术

药物肽通常通过作用于特异性受体，以特定的细胞信号传导途径发挥其特定的生物学功能，但许多药物肽因含有特定氨基酸组成或其分子量小，通过自身的代谢和肾的滤过作用，在生物体内被迅速降解或清除而丧失生理活性。提高肽类等分子药物的稳定性、延长其在生物体内的半衰期是现在许多新型分子药物研发的目标。适当增加、修饰或突变某些特定的氨基酸可以改善和提高某些肽分子药物的稳定性；而分子量小的药物肽与某些血浆组成成份融合表达或在生物体内与半衰期长的、可以作为药物运输载体的血浆蛋白结合，可显著改善他们的药物代谢动力学特性，提高药物肽在体内的半衰期和生理活性。

人血清白蛋白(HSA，分子量为66.478kDa.)是人体血浆中含量最为丰富的蛋白种类，浓度约为600μM，它也是人体血浆中主要的药物运输蛋白，在人体内的半衰期可达19天。许多药物肽或蛋白在生物体内与人血清白蛋白结合能有效的改善其代谢动力学特性，延长其半衰期，提高其稳定性和生理活性。

筛选与人血清白蛋白具有较高的专一亲和作用的短肽，专一亲和性短肽在血液中与人血清白蛋白结合，可使某些药物肽与专一亲和性短肽融合表达的融合多肽或蛋白在生物体内的半衰期有效延长。而目前筛选的人血清白蛋白亲和性短肽多为20个氨基酸或12个氨基酸的短肽，且较少有与人血清白蛋白具有高亲和力的短肽。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种与人血清白蛋白具有高亲和力的七肽。

本发明的另一目的在于提供所述与人血清白蛋白结合的七肽的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种与人血清白蛋白结合的七肽，其氨基酸序列如下所示：WQRPSSW；

所述与人血清白蛋白结合的七肽的编码核苷酸序列为：TGG CAG CGC CCG AGCAGC TGG；

所述与人血清白蛋白结合的七肽应用于与多肽构建融合蛋白；该融合蛋白可以与人血清白蛋白结合；

所述的多肽优选为药物多肽；该七肽与药物多肽融合后，显著提高药物肽在生物体内的稳定性及生理活性周期；

所述的药物多肽包括：治疗糖尿病的药物多肽如：PACAP及其衍生物；抗肿瘤的多肽如：TNF及其衍生物以及某些促进细胞凋亡的多肽等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明首次提供了由7个氨基酸组成的、且与人血清白蛋白专一亲和的、具有较高亲和力的短肽。短肽与某些药物多肽融合后，短肽的氨基酸个数越少，不仅有利于该短肽不易造成药物多肽作用位点的位阻，而且在生物体内不会存在抗原性影响。

附图说明

图1为含所选7-mer肽的噬菌体与人血清白蛋白的亲和作用曲线。

图2为重组多肽MHDBAY的制备示意图。

图3为MHDBAY基因合成及重组表达质粒pKY-MHDBAY构建示意图；

图中：MCS-多克隆位点；CBD-几丁质结合结构域；intein-内含肽。

图4为SDS-PAGE检测融合蛋白Intein-CBD-MHDBAY表达的鉴定图；其中，泳道1是IPTG诱导后菌体破碎上清液；泳道2是IPTG诱导前菌体破碎上清液。

图5为制备的重组多肽MHDBAY的飞行质谱鉴定图。

图6为重组多肽MHDBAY与BAY55-9837的稳定性比较与检测结果图。

图7为重组多肽MHDBAY/BAY55-9837和[¹²⁵I]PACAP38对VPAC2受体的竞争性结合检测结果图。

图8为重组多肽MHDBAY和BAY55-9837对ICR小鼠的急性糖耐量试验的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

人血清白蛋白亲和结合7-mer肽的淘选

利用New England Biolabs，Inc公司的随机七肽噬菌体展示文库(Ph.D.-7噬菌体展示肽库)筛选人血清白蛋白高亲和7-mer肽。

Ph.D.-7噬菌体展示肽库是将随机七肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，是一个组合文库，本文库包含的随机七肽序列数在10⁹以上，本文库的滴度为2×10¹³pfu/mL。

用固定靶分子直接包被平板法进行四轮淘选。

第一轮淘选：