[发明专利]一种快速检测啤酒中有害菌的方法

权利要求书

1.一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)快速增菌培养基的制备

培养基：取快速增菌培养基粉末(蛋白胨，酵母膏，牛肉膏，吐温80，磷酸氢二钾，醋酸钠，叶酸，放线菌酮，琼脂，葡萄糖，麦芽根浸粉，泛酸钙组成)溶于蒸馏水中，121℃灭菌15分钟，倒平板。该培养基能让有害菌快速增长，加快检测时间。

(2)微菌落荧光染色

取样液300-500mL，将经过高温灭菌的聚碳酸酯膜放至抽滤系统进行抽滤，取出滤膜放在快速增菌培养基上28℃厌氧培养30小时。然后将滤膜取下，避光染色，染色后清洗滤膜，洗掉染色液，以去除背景影响。

(3)荧光原位杂交试验

将进行过CFDA染色的膜片直接进行荧光原位杂交实验。将膜片进行蛋白酶K处理，取出膜片，浸入含有溶菌酶的磷酸缓冲液中处理，取出后，放入有乙醇的染色缸中，分别在质量分数为50％，80％，100％乙醇中脱水，每一浓度浸泡3min，添加10μL体积探针溶液(50ng/μL)和90μL杂交缓冲液到微量离心管中，冰浴中避光保存，杂交箱里放吸水纸，用杂交液湿润，添加20μL的杂交混合液、10μL的blocking regent到膜片上与样品混合，将膜片放入杂交箱里，恒温箱中进行杂交反应，将盛有清洗液的一个染色缸在48℃震荡水浴锅中预热，把膜片放入预热后的清洗液中，震荡洗涤膜片20-25min，取出膜片放至浸湿无菌水的无菌滤纸上洗去膜片下面的洗脱液。

(4)结果观察

将膜片放到载玻片上在荧光显微镜4×或10×下观察计数，采用蓝光激发，随机观察30-40个视野的微菌落，按下式计算样本中的菌落数：

X=A40×(Φ1Φ2)2÷V]]>

X为样本菌落总数(cfu/ml)；A为30-40个视野微菌落总数(cfu)；Φ₁为滤膜有效过滤直径(mm)；Φ2为油镜视野直径(mm)，V为滤过的样液量(ml)，计数后采用红光激发，观察荧光原位杂交实验结果。并对菌进行定性分析。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(1)中快速增菌培养基所含组分为：蛋白胨5～8g，酵母膏4～6g，牛肉膏6～10g，吐温800.5～1g，磷酸氢二钾1～2g，醋酸钠3～6g，叶酸0.1～0.2g，放线菌酮6～10mg，琼脂10～15g，葡萄糖10～15g，麦芽根浸粉0.1～0.5g，泛酸钙0.2～0.5g。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(1)中快速增菌培养基所含组分为：蛋白胨8g，酵母膏6g，牛肉膏6g，吐温800.8g，磷酸氢二钾2g，醋酸钠6g，叶酸0.2g，放线菌酮6mg，琼脂15g，葡萄糖15g，麦芽根浸粉0.5g，泛酸钙0.4g。

4.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(2)荧光微菌落染色是将聚碳酸酯膜放于浸湿CFDA染色液的无菌滤纸片上，避光染色5-15分钟，染色过后的滤纸片的清洗也是在浸湿无菌水的滤纸片上进行，以避免菌的损失。

5.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(3)荧光杂交是在滤膜片上进行，将膜片进行蛋白酶K处理温度是58℃，时间10分钟。取出膜片，浸入含有溶菌酶的磷酸缓冲液中处理时间是10分钟。

6.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(3)荧光杂交探针序列分别为：短乳杆菌检测探针：5’-TAGCCGGTGTAACCCTGACTCTG-3’，一端用Cy3标记；四联球菌检测探针：5’-GAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAA-3’，其一端用Cy3标记。