[发明专利]短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用，属于生物工程技术领域。更具体的，本发明涉及一种从短乳杆菌中利用PCR方法筛选克隆出新的谷氨酸脱羧酶基因、其表达的谷氨酸脱羧酶，及该酶或表达该酶的工程菌在制备γ-氨基丁酸中的应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(简称GABA)，又称氨酪酸，是一种重要的非蛋白质氨基酸。它不仅是中枢神经系统的一种重要神经递质，而且对人体还具有多种有益的生理功能。大量文献报道，GABA具有降血压和胆固醇、治疗癫痫，安神镇静、缓解抑郁症状、增强脑功能和长期记忆、调节激素分泌、预防糖尿病、健肝利肾、改善更年期综合症及提高精子的体外受精能力等功能。研究显示，人大脑的衰老有可能是因为其大脑无法得到足够量的化学物γ-氨基丁酸(GABA)而造成的。摄入GABA可以提高葡萄糖磷酸酯酶的活性，从而促进大脑的能量代谢，活化脑血流，增加氧供给量，最终恢复脑细胞功能，改善神经机能。

随着对GABA生理活性及作用的深入研究，GABA也日益受到关注。GABA成为一种既具有显著药理作用、可用于疾病治疗，又具有保健作用、可用于日常服用的“药食同源”的生理活性物质。国家食品药品监督管理局批准生产γ-氨酪酸(γ-氨基丁酸)片以及γ-氨酪酸注射液的药厂已经达到24个，主要用于治疗各种类型的肝昏迷。日本PCI公司利用发酵法生产γ-氨基丁酸，作为功能食品配料，已广泛应用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味料等制品。因此近年来对GABA需求也与日俱增。

制备GABA的方法主要包括化学合成法和生物合成法两大类。

最常见的化学合成方法就是以邻苯二甲酰亚氨钾和γ-氯丁氰在强烈条件下(反应温度高达180℃)反应，所得产物与浓硫酸回流水解，再经过结晶提纯而得。另有以吡咯烷酮作为原料，经氢氧化钙、碳酸氢铵水解制得GABA的专利报道。化学合成GABA虽然反应迅速，但是具有反应条件苛刻、安全性差、能耗大、成本高、副反应多以及环境污染严重等缺点。

生物合成法是利用生物体内的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)作为催化剂，将L-谷氨酸或其钠盐α-脱羧生成GABA。生物合成法包括植物富集法和微生物(酶)催化法两种。其中的植物富集法是利用植物中GAD催化L-谷氨酸或其钠盐产生GABA。但是植物所能产生的GABA极其微少，所以该方法难以用于GABA的大规模制备，目前仅用于增加大米、茶叶等农作物中的GABA含量、以提高这些作物的经济价值。微生物(酶)催化法是利用具有GAD活力的微生物(或酶)催化L-谷氨酸或其钠盐来制备GABA。与其他方法相比，微生物(酶)催化法合成GABA具有许多优点，最突出的是条件温和、专一性强、副产物少(酶法)、安全性高，是大规模制备食品或医药级GABA的理想途径。

微生物(酶)催化法制备GABA的关键是要获得高活力(谷氨酸脱羧酶活力)的微生物菌株或酶。但目前，利用微生物(酶)催化法制备γ-氨基丁酸存在的一个问题是所用的菌株常常兼性厌氧细菌，所以生长缓慢，培养周期长，导致γ-氨基丁酸的生产效率低。虽然也有克隆谷氨酸脱羧酶基因在大肠杆菌中进行异源表达的专利(申请号200710022222.3)，但所获得谷氨酸脱羧酶活力并不高，而且由于酶的最适温度高于常温，因此还要消耗额外的能量。此外，对于微生物(酶)催化法制备γ-氨基丁酸而言，由于菌体代谢的复杂性，所获的产物中除了γ-氨基丁酸外常常还有其他由于菌体自身代谢所产生的杂质。这需要对产物进行复杂的分离纯化才能得到合乎质量要求的产品，增加了生产成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术的上述不足，提供一种从保藏号为CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)中，利用PCR方法筛选克隆出短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因。

具体的，本发明提供一种短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因，该基因的DNA序列为SEQID NO.1，全长1407bp，来自保藏号为CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。该基因是一个尚未报道的DNA序列，其碱基组成特征如下表1所示：

表1短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306

谷氨酸脱羧酶基因碱基组成特征

该基因编码的推导氨基酸序列为SEQ ID NO.2。