[发明专利]一种定点整合外源基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种定点整合外源基因的方法。

背景技术

溶菌酶是人乳中重要的抗菌因子，对大部分革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌均具有杀灭作用，对于增强婴幼儿免疫力有着重要的作用，同时溶菌酶在医疗保健，轻工业、食品业等方面也被广泛应用。2009年美国FDA批准了世界上首例乳腺生物反应器生产的抗凝血酶转基因药物上市，这标志着利用转基因动物生产重组蛋白真正迈入产业化阶段。

利用乳腺生物反应器生产重组蛋白具有广阔的市场应用前景，但是传统的转基因技术在乳腺生物反应器研究中仍存在一定的不足。传统的转基因研究中，由于外源基因在基因组中是一种随机插入，受到位置效应的影响以及载体自身大小限制，不能包含完整的调控元件往往使外源基因的表达量水平较低，甚至不表达或者异位表达(Clark，1994；Dobie 1996；Kim，2007)。同时，由于外源基因的多拷贝随机插入到宿主基因组中，这种整合对宿主自身来说可能也存在一定风险(Seggewis，2006；McCormack，2004)。这些不利因素大大降低了转基因动物育种的可靠性，提高了成本，不利于转基因育种的发展。食品规范委员会和美国FDA颁布的转基因动物规范条例中也明确提出需充分重视这个问题。因此需要我们寻找使外源基因表达量更高，同时具有较高育种安全性和可靠性的新方法去改变传统的转基因育种。

为了提高外源基因的表达量，克服转入基因受到位置效应的影响，人们尝试了多种方法，如在载体中加入了核基质附着元件(MAR)、位点控制元件(LCR)、绝缘子(Insulator)等元件来克服外源基因表达受到位置效应的影响，但是由于基因表达调控的复杂性，仍不能取得很好的效果，而且外源基因在基因组上仍是随机插入，降低了转基因的可控性和安全性，这仍是在传统转基因研究急待解决的问题。基因打靶技术的出现克服了传统转基因的弊端，大大提高了转基因的可控性。基因打靶是基因靶向操作的一门转基因技术，利用外源基因与基因组序列间的同源性进行同源重组(homologous recombination)来实现定点对染色体进行修饰的一门技术，具有位点专一性强，可以稳定遗传以及外源基因不受位置效应影响，对邻近基因也没有影响等优点，将成为今后一种较理想的改造物种基因的操作方法。2000年K.J.McCreath利用基因打靶的方法将人抗胰蛋白酶基因(AAT)定点整合到羊原胶原基因座上(COL1A1)，羊乳中人抗胰蛋白酶表达量为650μg/ml(McCreath，2000)，远高于之前McClenaghan随机整合表达人抗胰蛋白酶的转基因羊乳中18μg/ml的表达量(McClenaghan，1991)，克服了传统转基因受位置效应影响使蛋白低水平表达的弊端。利用基因打靶进行转基因独有的优势使转基因研究具有了可控性，在转基因动物育种方面明显的提高了转基因的成功率，提高了转基因动物自身的安全性，降低了转基因育种的风险，同时便于规模化的育种。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效定点整合外源基因的方法，其可以大幅提高外源基因的表达量，提高育种成功率和安全可靠性。

本发明提供的定点整合外源基因的方法，其是采用基因打靶的方法将人溶菌酶基因或其它目的基因定点整合到牛、羊或兔等哺乳动物的乳腺特异表达蛋白的靶标基因座上，使溶菌酶基因或其它目的基因捕获完整的乳腺特异表达蛋白调控序列以及基因座上的调控序列，来实现人溶菌酶或其它目的蛋白在动物乳腺中的高效表达。这是首次尝试利用基因打靶的方法使外源基因捕获动物乳腺特异表达蛋白调控元件指导人溶菌酶的在乳腺中表达，同时我们用人溶菌酶的基因组序列代替cDNA序列，可使溶菌酶获得更高的表达量。利用这种新的方法可以克服以往转基因外源基因随机整合存在的种种不足，提高转基因育种的成功率。

根据本发明的一种优选实施例，采用基因打靶的方法将人溶菌酶基因定点整合到牛as1-酪蛋白基因座上，得到了一种根据上述方法构建的打靶载体，其具有如图15中所示的LYZ-K-in载体结构。其可以在牛乳腺中高效表达生产人溶菌酶或其它重组蛋白。

上述技术方案具有如下优点：

(1)人溶菌酶或其它目的基因在乳腺中转录非常活跃的酪蛋白基因座定点整合，克服位置效应，避免目的基因表达沉默，可以实现人溶菌酶或其它重组蛋白在乳腺中较高水平表达，提高了转基因育种的成功率，同时可以节约后期生产纯化重组蛋白成本；