[发明专利]GeXP多重PCR技术用于人乳头瘤病毒HPV检测和分型的研究

说明书

发明领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，哨点医院等用于对宫颈分泌物等标本的多种人乳头瘤病毒HPV亚型(包括HPV6，HPV11，HPV31，HPV33和HPV52)感染的同时检测和分型。具体通过计算机软件分析人乳头瘤病毒HPV各亚型基因的保守序列，分别设计出针对各亚型的型特异性引物，进行单管多重(6重)PCR(包括内参基因Rnasep-DNA)，整个反应不到2个小时。本专利既克服了常规单管多重荧光定性PCR检测不能分型的缺点，也克服了常规芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为HPV的分型技术提供了新的思路，其高特异、高灵敏、快速的特点为实现HPV亚型感染的快速准确筛查鉴别提供了有力的技术支撑，对研究患者HPV感染型别分布特点和提高由HPV各亚型引起的癌症病变的防治水平具有重要意义。

发明背景

宫颈癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，在一些发展中国家和地区仍居第一位。据全球范围统计，在所有妇科恶性肿瘤中宫颈癌占10％，每年有471,000例新发病例以及215,000例死亡病例。人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌密切相关，它是一种双链环状DNA病毒，由早期基因、晚期基因(晚期基因L1和L2分别编码主要衣壳蛋白与次要衣壳蛋白)和一个不翻译的上游调节区三部分组成，研究发现99％以上的宫颈癌有HPV感染，HPV是宫颈癌的主要致病因子。依据与宫颈癌的关系，将HPV分为高危型和低危型，高危型包括：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、66、69等型；低危型包括：6、11、43、44等型。HPV高危亚型中，中国南方地区52、58亚型的感染率较北方高，在台湾除HPV16、18外，31、33、35的感染率较高，说明在中国人中16、18、31、33、52、58为最常见亚型，但由于中国地域宽广，人口众多，故这方面的资料较为缺乏，有待进一步研究。低危亚型中，HPV6，11为常见感染亚型，可致巨大湿疣、尖锐湿疣、呼吸道乳头瘤、结膜乳头瘤等疾病。要进一步研究不同亚型HPV在不同种族人群中的致病性、治疗和预后情况，了解HPV临床感染类型的变化趋势以及降低宫颈癌的发生和死亡，就需要建立一种适合于临床应用的、能够对所有已知高危类型和常见低危类型HPV同时进行筛查和分型检测的新方法。故本研究初步选取中国人常见的HPV31，33，52三种高危型和HPV6，11两种低危型作为研究对象。

目前，HPV分型方法有很多，常见的有细胞学检测方法和分子生物学技术方法，如薄层液基细胞学技术和涂片自动检测技术、杂交捕获试验(HC)、原位杂交技术(ISH)和PCR方法等。其中，PCR技术较为成熟，具有快速、简便、灵敏等特点。由于单重PCR通量不高的的局限性，本研究采用一种新型的基于GeXP的多重PCR技术，它采用通用引物引发靶基因扩增，能有效解决多重PCR过程中的扩增偏爱性，采用毛细管电泳及荧光标记扩增产物提高的检测灵敏度和分辨率，根据扩增产物片段长度判断结果，有助于提高检测特异性。在我们的前期工作中，运用基于GeXP的多重PCR技术成功检测了新甲型流感病毒和季节性流感病毒。本研究首先用单重PCR技术检测HPV6，11，31，33和52单重感染的HPV临床样本，以验证GeXP引物的特异性，在此基础上建立了一种新型多重GeXP-PCR技术检测，以同时检测和鉴定生殖道感染中中国人常见的HPV6，11，31，33和52等亚型。

发明内容

1.以GenBank公布的引物序列为参考，从NCBI上下载已知序列使用CLUSTAL X软件进行序列比对，选取对于针对各个靶基因高度保守而对于其它型别高度特异的基因区段，由eXpress Profiler Software设计六重引物，如表1：

表1  GeXP检测人乳头瘤病毒(HPV)的核苷酸引物序列表

注：下划线表示的是上、下游通用引物序列

2.建立了如下的检测过程，详见如下：

(1)合成引物：由上海英骏公司合成并纯化。

(2)将待测标本按Qiagen公司的DNA Mini Kit试剂盒步骤处理，获得样本的DNA。

(3)6重PCR反应。

具体实施方式

实施方案1：Gexp多重PCR的反应体系和条件