[发明专利]枯草芽孢杆菌LS02漆酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌漆酶，具体涉及一株枯草芽孢杆菌LS02的芽孢漆酶的制备方法和催化性质，以及编码该芽孢漆酶的核酸片段。此外，本发明还涉及到该芽孢漆酶使合成染料脱色的方法，属于应用微生物领域。

背景技术

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，它可利用活性中心的铜离子催化氧化多种结构的芳香化合物，同时将分子氧还原成水。由于漆酶催化的底物范围十分广泛，因此漆酶酶已被广泛应用于造纸工业、纺织工业、食品工业以及土壤的生物修复等领域。

漆酶催化氧化底物一般包括两种作用方式，第一种是底物分子直接与漆酶铜簇反应氧化成相应的激发态分子。然而有些底物不能由漆酶直接氧化，原因在于它们分子太大而不能渗透进入酶的活性部位，或者由于其氧化还原电位较高而不能被漆酶直接氧化。漆酶氧化底物的第二种方式是通过一些小分子的介体物质为媒介，漆酶先将小分子介体氧化成激发态，然后这些激发态的介体再与大分子的或氧化还原电位较高的底物反应，该方式也被称为漆酶-介体系统(LMS)。漆酶-介体系统的应用有助于进一步扩大漆酶的底物范围，提高漆酶的工业应用范围。

在自然界中，漆酶广泛分布于植物、真菌和细菌中，特别是真菌，是目前漆酶的主要生产者。虽然目前对细菌漆酶的理论研究不如真菌漆酶深入，但细菌具有生长快、易于培养的特点，细菌漆酶较真菌漆酶在碱性环境和高温下具 有更好的稳定性。由于工业造纸废水等一般温度较高，碱性较强，真菌漆酶在实际应用中受到稳定性差的限制，因此细菌漆酶在工业上具有更好的应用前景。

漆酶在细菌中的存在主要有三种形式，即：细胞外漆酶、细胞内漆酶和细胞组成漆酶。得到的这三种形式的酶，酶的活性及稳定性不同。由于胞内酶需破壁获得，此形式的漆酶在破胞过程中酶活性降低较明显，且随着细胞的破碎各种细胞组份与漆酶混合，对酶的纯化也会带来困难；与之相比，另外的两种形式漆酶则优势显而易见，尤其是细胞组成漆酶，通常是芽孢菌属的细菌，由于细菌芽孢对高温、高压、极端pH以及高盐等多种不利因素具有较强的抗逆性，该种类漆酶会因芽孢这一特殊构造的特性而表现出更好的温度稳定性和pH稳定性。

随着分子生物学技术的不断发展，众多的漆酶基因已经得到了克隆和深入分析。研究漆酶编码基因的表达调控机制，有助于阐明不同基因在发育进程中所起的作用，此外，还可以通过定点诱变等技术对漆酶基因进行改造，提高漆酶工业应用性能。

染料被广泛应用于纺织、印染、皮革等行业，全球每年生产染料万种之余，至少有10-15％的染料通过废水排放到自然环境中，对水体的生态环境造成严重破坏。工业使用的合成染料多是芳香族化合物，结构复杂，难降解。目前染料废水的处理方法主要有物理化学法和生物处理法，物化处理技术费用高，存在二次污染，生物法因其经济环保而成为较好的治理方法。其中漆酶由于具有广泛的底物作用范围，可催化降解多种结构的染料，在工业染料废水处理上具有较好的应用前景。已有很多关于应用白腐菌或其它真菌来源的漆酶脱色染料的研究，但关于细菌漆酶以及细菌漆酶-介体系统在染料脱色方面的研究报道较少。通过研究细菌漆酶对不同合成染料的脱色效果，可以进一步推动细菌漆酶 的工业应用。

发明内容

本发明目的是提供一种枯草芽孢杆菌(Baciilus subtilis)LS02，同时本发明的目的还在于提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LS02产芽孢漆酶的制备方法，以及提供一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LS02产的芽孢漆酶脱色合成染料的方法。

本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LS02已于2010年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.4261。

上述枯草芽孢杆菌菌株是从中国黑龙江省伊春市凉水国家自然保护区森林表层土壤分离获得。枯草芽孢杆菌LS02菌株革兰氏染色阳性，芽孢中生，有鞭毛。在固体Luria-Bertani(LB)培养基上，37℃培养24h，菌落微黄色、扁平呈圆形，菌落表面湿润、光滑，菌落边缘呈叶状，菌落半透明且正反颜色一致。菌株的最适生长温度为37℃，最适生长pH为7.0，可耐受1％-13％的NaCl。

本发明提供了枯草芽孢杆菌LS02产芽孢漆酶的产孢培养培养基配方及芽孢漆酶的制备方法。