[发明专利]三疣梭子蟹微卫星SSR-18检测技术

说明书

技术领域：

本发明涉及到一种三疣梭子蟹微卫星位点遗传多态性的检测技术，可以应用于三疣梭子蟹遗传多态性检测和家系识别等领域，是一种DNA分子标记技术。

背景技术：

DNA分子标记是能够用来作为指纹鉴定或区分基因组中某种差异特征的DNA片段，这种标记在遗传学研究和生物技术应用方面越来越成为有用的工具。在基因组水平上，由于DNA上核苷酸碱基的突变造成不同的生物个体之间存在着一定的差别，进而造成许多基因组DNA序列的多态性，即这些序列在不同的个体间是有差别的。分子标记技术就是把这些差别用分子生物学方法表现出来的技术，目前主要有以下几种分子标记技术：限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP)、微卫星(Microsatellite)或简单重复序列(Simple sequence repeats，缩写SSR)、随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，缩写RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，缩写AFLP)、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，缩写SNP)技术等。其中微卫星分子标记技术(Microsatellite)是由串联重复序列组成，其核心序列为1-6个核苷酸，其中两碱基重复数目最多。微卫星分子标记技术利用PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增的原理，在核心重复序列区两端非重复序列区设计PCR扩增引物，扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，经染色处理后可以显示出扩增的结果。微卫星广泛分布于真核生物基因组中，因重复单元数目不同而呈现高度多态性，已成为非常重要的分子遗传标记之一，具有数量多、分布广且均匀、多态性丰富、分析快速方便等一系列优点，并具有重要的理论意义和深远的应用前景。该技术最早于1994年由Zietkiewicz创建。微卫星呈孟德尔共显性遗传，可以区别纯合显性个体和杂合显性个体，是家系或者个体识别以及群体遗传多态性分析的有用工具。值得一提的是，通常所说的微卫星技术是泛指一切以基因组中核心重复序列区重复序列的多态性为检测对象的技术，具体到基因组中的各个重复序列区，则每个重复序列所在的序列区被称为微卫星基因座，针对每个基因座可以开发出相应的微卫星位点检测技术，本专利所申请的就是这样一种特定基因座的分析检测技术。

目前，海洋生物中已经广泛利用该技术进行了群体遗传多态性分析、遗传图谱构建、系谱认证等工作。在海洋水产生物三疣梭子蟹中的研究起步较晚，开发出来的微卫星数量也较少，但少数开发的几个微卫星基因座扩增技术都申请了国家发明专利，如“三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测技术”(200810017119)、三疣“梭子蟹ptssr17微卫星DNA标记的检测技术”(200810017118)。鉴于微卫星分子标记技术在遗传结构分析中的广泛用途，开发更多的三疣梭子蟹微卫星基因座分子标记检测技术具有重要的理论和应用价值。

发明内容：

本发明描述了一个新的三疣梭子蟹微卫星基因座检测技术，为三疣梭子蟹家系识别和遗传结构分析提供了一个新的技术，主要内容为通过提取三疣梭子蟹基因组DNA，利用含有重复序列的随机引物PCR扩增基因组DNA，利用扩增产物建立基因组文库，对基因组文库进行测序，查找测序序列中含有微卫星重复序列的片段，以重复序列为核心设计微卫星扩增引物，以PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色的方法检测这些引物的扩增结果，从中挑选出一个编号为SSR-15微卫星引物，建立一个适合于三疣梭子蟹家系识别和遗传结构分析的微卫星基因座检测技术。

附图说明：

图中显示的编号1-20为来源于不同家系的混合个体，21-30为单一家系的10个个体，M为DNA分子量标准Marker的缩写。微卫星SSR-18在1-30个个体中检测出来的基因型见表1。在编号1-20个体中，共扩增出106bp、178bp、202bp、211bp、218bp、219bp、235bp、243bp共8个等位基因，在编号21-30单一家系10个个体中共扩增出211bp、231bp三个等位基因，而且这些等位基因在这一单个家系中的分布规律符合来源于同一家系父母本在某一等位基因座的遗传分离规律，即从中可以推断出父亲和母亲的基因型均为211/231。图中分子量Marker有三条带，最上面的条带指示的标准为250bp。

具体实施方式：