[发明专利]培养碱性土壤中优势菌--真菌的方法

说明书

技术领域：

本发明属于土壤微生物的分离纯化技术领域，尤其是涉及一种碱性土壤培养优势菌真菌的分离纯化方法。

背景技术：

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。土壤中微生物主要有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物。微生物以细菌数量最多，细菌占土壤微生物总量的70％～90％，且种类多，多数是异养菌。放线菌的数量仅次于细菌，多存在于偏碱性的土壤中，主要是链霉菌属、诺卡菌属和小单孢菌属等。土壤中的微生物有些对农业有害，如反硝化细菌，能把硝酸盐还原成氨散失到大气中，降低土壤肥力，但多数是对农业有益的。土壤中的真菌有许多能分解纤维素、木质素和果胶等，对自然界物质循环起重要作用。真菌菌丝的积累，能使土壤的物理结构得到改善。放线菌能产生抗生素。总之土壤中的微生物对增加土壤肥力、改善土壤结构、促进自然界的物质循环具有重要作用。

针对土壤中不同的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。目前我们经常所做的是从土壤中分离细菌、真菌、放线菌三类优势菌，通常采用的是牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌、高氏一号培养基培养放线菌、马丁氏培养基培养真菌，针对不同的菌种配制PH值不同的培养基以适合各类菌种的培养。一般从土壤中分离微生物的目的是测定不同的微生物在土壤里的含量，其优势菌有哪几种，但是，培养基都是参照菌种的适宜生长条件配制的，而与它原生的土壤条件存在差异，这是不符合实际的一种测定方法。测出的数据存在一定的误差，因而经常所用的这种培养基培养方法不能很好的表达土壤中微生物的含量，影响了从土壤微生物分离纯化研究的进一步发展。

发明内容：

为克服现有技术的缺陷，打破常规的培养基培养菌种的方法，本发明目的旨在提供一种碱性土壤培养优势菌真菌的方法，实现真菌的培养基培养条件与土壤中的生长条件保持一致，以利于更加精确地测得碱性土壤中其优势菌--真菌的含量。

为了实现上述目的，本发明从碱性土壤中分离出真菌，利用改良的马丁氏培养基培养真菌，使培养基培养条件与土壤中真菌的生长条件保持一致，测定其真菌的含量，具体采用如下技术方案：该方法通过以下步骤实现：

(1)样本采集及处理

采用对角线5点取样法，每点分别取地表10cm和15cm深度土壤，等份混匀，过30目筛子，用无菌塑料袋分装，立即置于4度冰箱中保存。在24小时内进行真菌培养。

(2)培养基的配制

马丁氏培养基由如下组分以重量份组成：K₂HPO₄1份，MgSO₄.7H₂O 0.5份，蛋白胨5份，葡萄糖10份，琼脂15-20份，水1000份，1％孟加拉红水溶液2.5份，自然pH。

改良后的马丁氏培养基由如下组分以重量份组成：K₃PO₄1份，NaCl 4份，MgSO₄.7H₂O 0.5份，蛋白胨5份，葡萄糖10份，琼脂15-20份，水1000份。用10％NaOH调其PH与上述碱性土壤的PH值一致，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。按上述组分称量，并将其溶解在水中；调其PH与碱性土壤的PH值一致；将其分装、包扎、灭菌。

(3)制作平板

将步骤(2)经过灭菌的马丁氏培养基置于水浴锅中冷却到45-50℃立刻倒平板，培养基需满皿底的2/3，凝固后即制成平板。

(4)制备土壤稀释液

称取步骤(1)采取的碱性土样，使土样与无菌水充分混合，成为土壤悬液，经过稀释制备出不同稀释度的土壤稀释液。

(5)涂布

用无菌吸管分别从步骤(4)制得的不同稀释度的土壤稀释液中各吸取菌液涂布均匀于步骤(3)已备好的平板上；静置，放入温箱倒置培养。

(6)优势菌的分离纯化