[发明专利]辣椒疫霉荧光定量PCR检测法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明为一种荧光定量PCR检测辣椒疫霉的方法，专用于检测辣椒疫霉，属于农作物病害诊断与防治技术领域，同时还包括检测用试剂盒。

背景技术

辣椒疫霉寄主范围很广，可以侵染植物地上和地下部分，引起茄科、瓜类疫病。疫霉菌以厚垣孢子或卵孢子形式在土壤中存活。在保护地农作物种植栽培过程中，辣椒疫霉引致的辣椒上的土传病害发生越来越严重，发病严重的辣椒幼苗，先在茎基部形成暗绿色水渍状病斑，迅速褐腐缢缩而猝倒。有的茎基部呈黑褐色，幼苗枯萎死亡。叶片感病，病斑圆形或近圆形，直径2-3cm，边缘黄绿色，中央暗褐色。因其发生具有隐蔽性，大多在结果期才达到发病的高峰期，因此损失巨大，严重影响了保护地的发展与人民的经济收入。

辣椒疫霉菌的传统鉴定方法是采用选择性培养基进行分离培养，菌落形态观察，显微镜下观察病菌的菌丝体，孢子等特征，结合田间发病植株症状的观察，确定病原菌的种类。传统的鉴定方法在很多方面存在一定误差和困难，尤其是对疫霉菌的准确鉴定具有很大局限性，所以仅依靠传统的分离培养方法及显微镜观察是不够的，为了便于准确鉴定，还需要其他补充技术，尤其是分子生物学技术的应用。随着分子生物学技术的日益成熟和广泛应用，人们有可能避开传统的分离培养过程，通过DNA水平上的研究，对植物组织及土壤中的病原菌进行鉴定。

定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术(rea1-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过扩增产物熔解曲线分析可以特异的检测和鉴定某种病原真菌，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域，但在农业研究领域，尤其是在辣椒疫霉的定性定量检测研究中应用的较少。

发明内容

本发明的目的在于克服辣椒疫霉传统检测鉴定方法的不足，提供一种辣椒疫霉的荧光定量PCR快速检测方法。该方法采用根据辣椒疫霉ITS区所设计的特异性引物，优化荧光定量PCR反应体系，实现对发病植物组织中及土壤中的辣椒疫霉的快速检测定量。利用实时荧光定量PCR检测技术体系，可以特异的检测和鉴定辣椒疫霉，并且可以作为辣椒疫霉侵染辣椒植株过程中的监测手段。不仅提高了检测的准确性，还节约了检测时间。

根据上述方法设计的试剂盒，在植物病害诊断与防治领域可以大规模推广。

辣椒疫霉的PCR检测方法，以辣椒疫霉的DNA为模板进行PCR扩增检测，其特征在于：在PCR扩增反应体系中加入有如下一对特异性引物：

特异性引物ljym1：5’-TTGTTTTAAACCCATTTCACAATT-3’，

特异性引物ljym2：5’-CCACAGCAGGAAAAGCATT-3’。

所述PCR反应体系为：10×PCR buffer 2μL，15mM MgCl₂0.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，5μM引物ljym1/ljym2各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水13.7μL，终体积为20μL，扩增检测的程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

所述PCR检测为实时荧光PCR检测。

所述PCR扩增反应体系中加入有荧光标记为SYBR Green Supermix。

所述PCR反应总体积为20μL，其中包括SYBR Green Supermix用量10μL，浓度为10μM/L特异性引物ljym1用量1μL，浓度为10μM/L特异性引物ljym2用量1μL，DNA模板用量1μL，其扩增程序为：

第一步：95.00℃3分钟，1个循环；

第二步：：95.0℃45秒，65.0℃45秒，55.0℃1分钟，45个循环；

第三步：55.0℃10分钟，95.0℃1分钟，1个循环；

第四步：55.0℃1分钟，

第五步：55.0℃10秒，80个循环。

所述DNA模板来自于植物组织或土壤。

辣椒疫霉的检测试剂盒，其特征在于包括一PCR反应体系，该反应体系中含有上述特异性引物对ljym1/ljym2。