[发明专利]FFPE样品核酸文库,其构建方法和FFPE样品分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因组学领域，特别是福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)样品核酸文库、其构建方法及一种FFPE样品的分析方法。 

背景技术

组织样品的保存多采用福尔马林固定石蜡包埋的方法，该方法在临床和科研领域的应用已有一个世纪。数量巨大的归档FFPE样品为回顾性研究，阐明疾病机制，发现治疗靶标和指示预后提供宝贵的资源。现阶段FFPE样品仅限于病理学观察，分子水平的研究正在兴起，可行性尚无定论。FFPE样品的研究极具挑战，首先，石蜡包埋的医疗样本十分珍贵，每个样本总量都很有限且不可替代；其次组织样品在离体后就开始发生降解，福尔马林的固定会使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有巨大的影响。因此如何从有限的且容易发生核酸降解的FFPE样本中成功提取可用于后续反应的核酸成为其用于分子水平回顾性研究的关键。 

第二代测序技术(next generation sequencing，NGS)，例如SOLEXA、SOLID、和454测序平台等^[1]，大大提高了测序速度，同时测序成本显著降低。但某些全基因组测序项目的费用还未达到人人都能承受的水平，因此选取感兴趣的目标区域，通过特定的方法富集目标区域后测序，能大大降低测序成本，缩短研究周期，集中精力深度挖掘数据。人类全基因组的大小约为3Gb，其中蛋白编码序列仅占1％，约30Mb，以散在分布的外显子形式存在，约18万个。人类基因组的突变主要集中在外显子，占85％，且外显子的突变与疾病的发生密切相关，因此，选择性 的测定外显子序列是一个高效的研究人类疾病的策略。外显子测序是富集全基因组中的外显子，而后进行测序的技术，其富集方法有NimbleGen的基于DNA微阵列的固相杂交和Agilent的Sureselect液相杂交技术等。利用外显子测序技术可高效地对多份FFPE样本的外显子序列进行测定，并对外显子区域的变化进行分析，从而找到与疾病发生相关的基因，为疾病的预防、诊断和治疗提供依据。 

由于FFPE样本的特殊性，目前尚未有FFPE样本可否用于外显子捕获测序的论证，并且也没有相应方法的报道。虽然已经有许多商品化的FFPE样本DNA提取试剂盒，如Ambion公司的RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit，QIAGEN公司的 DNA FFPE Tissue Kit等。DNA提纯的主要步骤包括二甲苯脱蜡，乙醇去除二甲苯，组织裂解缓冲液和蛋白酶K消化组织，高温帮助恢复分子交联以及DNA纯化。完全按照试剂盒的方法提取的FFPE核酸并不能很好地用于某些分子水平的研究^[2]。 

发明内容

发明人面对现有技术的缺陷，通过提供一种FFPE样本核酸文库及其构建方法，建立了将核酸测序技术和目标序列捕获技术用于分析FFPE样本的方法。 

本发明的一个方面提供了一种FFPE样本核酸文库的构建方法，包括以下的步骤： 

步骤一FFPE样本核酸的提取； 

步骤二核酸片段化 

片段化的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，从而将核酸打断为大小为200-300bp的片段； 

步骤三DNA片段末端修复及3’端连接“A”碱基； 

步骤四接头的连接 

将末端连接“A”碱基的DNA随机片段末端连接序列已知的接头； 

步骤五片段选择 

将连接产物进行琼脂糖电泳，选择350-400bp进行切胶纯化； 

步骤六PCR扩增 

根据已知的接头序列设计引物，进行PCR扩增，即得到FFPE样本核酸文库。 

本发明提供的FFPE样本核酸文库的构建方法的一个实施例中，步骤一所述核酸的提取包括以下步骤：