[发明专利]转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取与检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种转基因作物植酸酶的提取与检测方法优化，具体是一种适用于转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取与检测方法。

背景技术

自1990年，美国孟山都公司和迪卡公司首次获得转基因玉米以来，转基因玉米产业取得了巨大的成功。2009年，全球转基因玉米种植面积1.58亿公顷，占全球转基因作物种植面积的26％。2009年，转植酸酶基因玉米获得农业部正式颁发的农业转基因生物生产应用安全证书。植酸酶(Phytase)属于磷酸水解酶，是将植物中的植酸及其盐类水解为可以利用的无机磷酸和肌醇的酶的统称。植酸酶有3种类型：肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶、肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶和非特性的正磷酸盐单酯磷酸水解酶。

植酸酶的生物功能主要表现在：(1)植酸酶能够催化分解植酸，提高植酸磷的利用率，减少环境磷污染；(2)消除植酸对矿物元素、蛋白质、营养作用，提高植物的营养价值。

磷是动物体内不可缺少的营养元素，磷的缺乏会影响动物生长，导致动物的生产性能下降。由于单胃动物(如猪，家禽和鱼类等)消化道缺乏分解植酸这种有机磷的酶类，几乎不能利用饲料中丰富的植酸。因此需要在饲料中添加价格昂贵的磷酸氢钙等无机磷来满足动物的需要。这样既造成磷源浪费，又导致未被利用的植酸随动物粪便排泄造成严重的环境污染。因此，将植酸酶基因转入到植物中，可以获得植酸酶含量较高的饲料原料，减轻浪费和环境污染。目前饲料中植酸酶活性测定已有国家标准，但是植物中植酸酶活性测定方法尚无国家规定的方法。本发明对植物中植酸酶活性测定中的提取方法与检测方法进行研究，目的是优化提取条件与检测条件，为测定结果的准确性提供保证。

经过查阅文献资料发现，从2009年10月1日起，由国家质检总局(CN-GB)发布的GB/T 18634-2009《饲用植酸酶活性的测定--分光光度法》标准正式实施。然而，在对现有专利和文献的分析中发现，还没有任何转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取与检测方法的专利和文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶提取的最佳条件，本发明的另一个目是研究优化植酸酶的最佳检测方法，以克服在测定植酸酶活性的过程中发生的酶活性变化较大，数值不稳定的弊端，为进一步测定植酸酶活性结果准确性提供保障。

为实现上述目的，本发明提供一种转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法，其特征在于：提取液pH为5.50，料液比为1∶4，提取时间为15min。

一种转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的检测方法，其特征在于：将上述提取物与浓度为0.1mmol/L的底物应用液在pH为5.50的乙酸缓冲溶液中反应30min。

酶的化学本质是蛋白质，在提取和检测过程中容易受到多种因素的影响和制约。本发明采用正交试验法对转基因玉米中植酸酶的提取方法和检测方法进行优化，主要研究了pH值、料液比和提取时间等因素对植酸酶提取的影响，以及反应时间、底物应用液浓度、pH值等因素对植酸酶测定的影响。

本发明的有益效果是：优化转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法，在《饲用植酸酶活性的测定--分光光度法》标准的基础上，进行优化实验，最终确定转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶提取与测定的最佳方法，为构建转植酸酶基因玉米安全评价体系提供相关数据。

附图说明

图1为本发明的磷标准曲线示意图。横坐标为无机磷的量，纵坐标为吸光度值。直线回归方程为y＝0.366x+0.0054，R²＝0.9999。

图2为本发明的不同料液比对植酸酶活性的影响示意图。横坐标为不同料液比，纵坐标为植酸酶活性。

图3为本发明的不同提取时间对植酸酶活性的影响示意图。横坐标为提取时间，纵坐标为植酸酶活性。

图4为本发明的不同pH值对植酸酶活性的影响示意图。横坐标为不同pH值，纵坐标为植酸酶活性。

图5为本发明的反应时间比对植酸酶活性检测的影响示意图。横坐标为不同反应时间，纵坐标为植酸酶活性。

图6为本发明的不同底物应用液浓度对植酸酶活性检测的影响示意图。横坐标为底物浓度，纵坐标为植酸酶活性。

图7为本发明的不同pH值对植酸酶活性检测的影响示意图。横坐标为不同pH值，纵坐标为植酸酶活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。此实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作。

一实验材料