[发明专利]一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用

说明书

技术领域

固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用，具体地说是从肠杆菌9043C₁₂中分离纯化得到酸性脲酶；将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃下自然干燥脱水成膜，微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。

背景技术

酸性脲酶（acid urease）是能将尿素（脲）分解为氨和二氧化碳或碳酸铵的酶。该酶广泛分布于植物的种子中，但以大豆、刀豆中含量丰富。也存在于动物血液、尿和微生物体内。能耐受酸性环境，在pH4.0~5.5的体系中仍具有活性。尿素是酒中由微生物代谢过程中所产生的副产物，是形成氨基甲酸乙酯的前体物质。

氨基甲酸乙酯（EC）是发酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪等)和酒精饮料(如葡萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清酒等)的伴随产物。氨基甲酸乙酯对人的危害主要来自酒精饮料的饮用。调查显示，氨基甲酸乙酯含量大于30×10^-6 μg/L的酒，人饮用后易患癌；在麦芽饮料中氨基甲酸乙酯几乎不可测，而果酒白兰地中平均含有10×10^-9~73×10^-9 μg/L，黄酒及清酒中约20×10^-9~300×10^-9 μg/L，多数威士忌酒中氨基甲酸乙酯的量为50×10^-9~200×10^-9 μg/L，餐饮葡萄酒中约7×10^-9~12×10^-9 μg/L。

经研究，氨基甲酸乙酯是由氨甲酰化合物与乙醇自发反应生成的：

根据酒中尿素来源和尿素与乙醇反应机理控制酒中EC含量可有三个途径：①适当的控制发酵条件，比如温度、pH值等；②选育低尿素的酵母菌；③在发酵后的酒中添加适量的酒用酸性脲酶，以分解形成的EC前体物质尿素。

以上消除EC的三种方法中，尤以第三种方法最为可行。此法不但简易、见效快，且具有以下明显特点：不改变原酒的风味特性；不改变原酿造酒的工艺条件，使生产不受影响；降低酒中EC的含量可达90%左右；而且在成酒中不会检测到活性酸性脲酶的存在。

我国的绍兴黄酒在国际上尤其在日本拥有广阔的市场。1987年，日本有关部门提出，绍兴黄酒中有EC超标现象，希望厂家采取措施控制EC的含量。目前，酒用脲酶在我国尚未形成生产能力，酿酒生产中需要的酒用脲酶需花费大

量外汇从国外进口。因此，研究酒用脲酶对我国酿酒业的发展，拓展国际市场等均有深远的意义。

游离酸性脲酶由于活力不易保持、难于重复利用和难于长期贮存等缺点，其应用受到一定的限制。而固定化酸性脲酶可作为一个良好的反应系统，使自然的酶结合于不溶性的载体材料上．使酸性脲酶稳定性得到加强，且可重复利用。酶膜将酶的催化功能与膜的分离功能交叉融合，在降低成本的同时极大地提高了反应效率。此外天然大分子壳聚糖材料无毒，亲水性好，具有适合酶催化反应的天然微环境，并且价格低廉，来源丰富，可应用于食品行业。故而该固定化酸性脲酶酶膜有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法，从肠杆菌9043C₁₂中分离纯化提取得到酸性脲酶，将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃下自然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜，该固定化酸性脲酶的最适温度为40℃，最适pH为4.5，贮存半衰期为40天，酶活回收率为64.3%；本发明还涉及这种固定化酸性脲酶酶膜的应用，在黄酒中加入该固定化酸性脲酶酶膜后首次尿素去除率能达到73％，连续使用10次后，尿素去除率仍可达50%。该酸性脲酶酶膜产品以膜作为固定的载体，接触面积大，可以重复使用，具有其他载体不可比拟的优点；应用于黄酒中，可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，是目前较为理想的去除酒中尿素的方法。

本发明的技术方案：固定化酸性脲酶酶膜的制备方法，从肠杆菌9043C₁₂中分离纯化得到酸性脲酶，将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃自然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜，其工艺为：

A．酸性脲酶的提取：

（1）菌种：采用实验室已有肠杆菌（Enterobacter sp.）9043C₁₂，该菌株已在《浙江农业大学学报》22（5）：493~498，1996公开。

（2）种子培养：