[发明专利]重组对虾蛋白SF-P9及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术、药物，以及动物、植物病害防治领域。更具体涉及一种含有对虾肽基因penaeidine的重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen，一种重组对虾蛋白SF-P9的氨基酸序列及其对应的DNA序列，一种对虾蛋白F-P6的氨基酸序列及其对应的DNA序列，以及含对虾蛋白SF-P9和F-P6的药物组合物。同时还涉及一种表达重组对虾蛋白SF-P9的酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的构建方法，本发明涉及的对虾蛋白SF-P9和F-P6具有明显的抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌感染的生物学活性，以及抗真菌感染活性和抗病毒感染的生物学活性，同时还涉及对虾蛋白SF-P9和F-P6具有抑杀肿瘤细胞的生物学活性。对虾蛋白SF-P9和F-P6作为制备治疗或预防动物和植物的细菌、真菌、病毒病和肿瘤病的药物中的用途，同时还涉及对虾蛋白SF-P9和F-P6在医药、化妆品、食品、饲料等产品制剂中的用途。

背景技术

抗菌肽广泛分布于哺乳动物、两栖动物、甲壳动物、软体动物、植物和昆虫等多种生物体内(Ryan et al.,1998,Harder et al.,1997, Chan et al.,1996, Destoumieux et al.,1997,Chan Bae Park., 1997,Francisco et al.,1998， Cociancich et al.,1994)。抗菌肽是特定基因编码的一类小分子多肽，具有广谱高效的抗细菌活性，某些抗菌肽还具有抗真菌、抗原虫、抗病毒、抗肿瘤细胞的功能（张永莲等，2002，Michael C et al., 2003Leuschner et al，2004，Mader et al，2005）。

对虾抗菌肽Penaeidin是普遍存在于对虾中的一类活性物质。在大西洋白对虾（Litopenaeus setiferus）、斑节对虾（Peneaus monodon）、中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）和日本对虾（Penaeus japonicus）等甲壳动物中均有Penaeidins。Penaeidin在虾类的先天免疫应答中具有重要的作用（Bachère et al,2004）。目前，已发现PEN2、PEN3、PEN4（PenBase V2.1）3个亚群（subgroup）。

Penaeidins在一级、二级结构上具有抗菌肽的基本共性，但在结构和生物学功能上的共同特征是：（1）分子量小。（2）都是阳离子肽（等电点分别为9.34，另一个的等电点为9.84）。（3）N-端富含脯氨酸Pro，推测Penaeidins富含脯氨酸的N-端结构介导Penaeidin与靶细胞的相互作用而非直接发挥抗菌活性。同时，Penaeidins的富含脯氨酸结构域决定了抗微生物肽的靶微生物的种类特异性。（4）C-端富含半胱氨酸Cys，C端含有6个半胱氨酸，具有3个分子内二硫键，C端成环状（Destoumieux et al,1997）。C-端富含Cys区域表面具有抗菌活性所必需的疏水性特点，从而Penaeidins具有对革兰氏阳性菌G+和革兰氏阴性菌G-的广谱抗菌活性。（5）Penaeidins C-端区域具有一个保守的几丁质结合模体，具有粘合几丁质的特性（Bachère et al,1999）。Penaeidins通过与真菌细胞壁上的几丁质相互作用而发挥其抗真菌活性。（6）Penaeidins具有翻译后修饰的特性，如成熟Penaeidin-2和Penaeidin-3a的C-端以酰胺化形式存在，这种翻译后修饰可能与稳定蛋白的螺旋结构，增强多肽与细胞膜之间的静电作用相关。（7）Penaeidins的N端和C端可协同作用。Penaeidins的N端带正电，自由伸展，该区域先微弱地锚定到细胞膜上。由于C端具有疏水性，高度稳定，故C端与细胞膜的疏水相互作用加强这种锚定效果。最后，肽链粘贴在细胞膜表面，或者插入膜上的孔洞而发挥作用（Yang et al,2003）。两种结构域的协同作用决定了penaeidin对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的广谱抗菌活性。