[发明专利]重组猪趋化因子CXCL12哺乳动物细胞表达质粒的构建与应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种重组猪趋化因子CXCL12哺乳动物细胞表达质粒的构建与应用，属于生物技术领域。

(二)背景技术

趋化因子CXCL12又称基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，是小分子的细胞因子，由116个氨基酸残基构成，属于趋化因子蛋白家族。它有两种形式，SDF-1α/CXCL12a和SDF-1β/CXCL12b。CXCL12趋化因子有四个保守的半胱氨酸残基形成两对二硫键以构成趋化因子的特殊结构。第一第二半胱氨酸残基之间隔着一个介入氨基酸残基。

趋化因子CXCL12对淋巴细胞有强烈的趋化作用并在发育中起重要作用。在胚胎发育中CXCL12引导造血干细胞从胚胎肝脏到骨髓的迁徙。CXCL12基因敲除的小鼠常常死于胎中或出生后1小时内。SDF-1α/CXCL12a还可以影响神经元的电生理。CXCL12可以在许多组织(包括脑，胸腺，心，肺，肝，肾，骨髓，脾脏)中表达。

pcDNA3.1V5-HisA是Invitrogen公司设计的5.5kb质粒，用于在哺乳动物细胞系中表达外源目的基因，含有V5和His标签及氨苄青霉素和新霉素抗性基因。

(三)发明内容：

本发明的第一个目的是将PCR扩增获得的猪CXCL12基因与哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1V5-HisA重组构建一种可在哺乳细胞内表达重组猪趋化因子CXCL12的表达质粒(pcDNA3.1/CXCL12)。

本发明的另一个目的是重组猪趋化因子CXCL12蛋白在增强疫苗免疫反应中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种重组猪趋化因子CXCL12哺乳动物细胞表达质粒，它的核苷酸序列表如SEQ ID NO：1所示。其CXCL12蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种重组猪趋化因子CXCL12哺乳动物细胞表达质粒是利用含启动序列的特异性引物：上游引物：CGGGATCCATGGGTGTCAAGGTCC；下游引物：CGGAATTCGCTCCTGCTGGTGATG。通过RT-PCR方法从猪脾淋巴细胞总RNA扩增猪CXCL12基因。猪CXCL12基因与商品化pcDNA3.1V5-HisA表达质粒重组，构成重组猪趋化因子CXCL12哺乳细胞表达质粒(pcDNA3.1/CXCL12)。含有pcDNA3.1/CXCL12质粒的大肠杆菌，已于2009年11月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CCTCC)，保藏编号为CGMCC NO：3416，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

本发明还包括上述重组猪趋化因子CXCL12哺乳动物细胞表达质粒在趋化不同动物白细胞方面的应用。

重组猪趋化因子CXCL12哺乳动物细胞表达质粒被转染到宿主细胞(如HEK293细胞)后，猪趋化因子CXCL12基因可表达猪趋化因子CXCL12重组蛋白，同时在宿主细胞浆中表达报告基因V5和6*组氨酸多肽。利用V5或6*His亲和层析柱，可制备纯化的重组猪趋化因子CXCL12蛋白，重组猪趋化因子CXCL12蛋白可趋化多种猪白细胞到达抗原或疫苗进入部位，从而增强疫苗免疫反应。

本发明的有益效果是：利用本发明构建的pcDNA3.1/CXCL12哺乳动物细胞表达质粒转染HEK293细胞，制备重组猪趋化因子CXCL12蛋白。由于CXCL12趋化多种白细胞到达抗原或疫苗进入部位，重组猪趋化因子CXCL12蛋白可作为分子佐剂增强蓝耳病等动物病毒疫苗的接种效果。

(四)附图说明

图1通过PCR扩增的CXCL12基因电泳结果

M：DNA分子量标准2000；

1：RT-PCR扩增的CXCL12基因(364bp)。

图2.pcDNA3.1-CXCL12重组质粒的酶切鉴定

M：DNA分子量标准2000；

1：BamH I/EcoR I酶切pcDNA3.1-CXCL12

图3.pcDNA3.1-CXCL12在HEK293FT细胞中瞬时表达的IFA检测

A：HEK293FT细胞对照；

B：pcDNA3.1/V5HISA空质粒对照；

C：pcDNA3.1/CXCL12重组质粒转染HEK293FT细胞。

图4重组猪趋化因子CXCL12哺乳细胞表达质粒结构图

CMV启动子(CMV promoter)：bases 209-863

T7启动子(T7 promoter/priming site)：bases 863-882