[发明专利]一种植物叶绿素酶的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物叶绿素酶的纯化方法，具体地，依次采用有机溶剂沉淀、离子交换层析和非变性凝胶电泳方法，简洁地从植物蛋白粗提液中分离得到纯化的叶绿素酶，属于植物生物技术领域。

背景技术

叶绿素酶(Chlorophyllase，EC 3.1.1.14)，催化叶绿素水解生成脱植醇叶绿素和植醇。1913年，Willstatter和Stoll首次报道了植物中存在叶绿素酶，其后，叶绿素酶的生理功能及其应用研究得到了迅速的发展，概括为：(1)叶绿素酶的生理功能；(2)细胞内分布；(3)酶的生化动力学特征；(4)基因克隆与诱导表达；(5)油脂加工的脱绿。

上述研究与应用的基础在于得到纯的叶绿素酶蛋白。目前，植物叶绿素酶的分离纯化主要是利用硫酸铵分级沉淀、疏水层析、离子交换、分子筛过滤等方法，过程复杂，酶收率低。例如Tsuchiya等(Tsuchiya T，et al. Purification and characterization of two isozymesof chlorophyllase from mature leaves of Chenopodium

Shioi等(Shioi Y，et al.A simple purification method for the preparation ofsolublized chlorophyllase from Chlorella protothecoides，AnalvticalBiochemistry，1980，105(1)：74-79)采用硫酸铵分级沉淀、Sepharose CL-6B和Sephadex G-200分子筛层析纯化小球藻的叶绿素酶，提高了酶的收率，简化了纯化程序，但是对于复杂的植物细胞体系，该方法所得酶的纯度达不到要求。

因此，改良植物叶绿素酶纯化的方法，简化纯化步骤，在保持酶活性的同时，达到纯度要求，具有一定的价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物叶绿素酶的纯化方法，简化纯化步骤，在保持酶活性的同时达到叶绿素酶纯度的要求。

实现上述目的的技术方案如下：

(1)有机溶液沉淀

植物蛋白粗提液，在4℃下边搅拌边缓慢加入有机溶剂，有机溶剂可选用乙醇、甲醇或丙酮中的任一种，控制有机溶剂的体积比浓度为20-40％；随后10000-12000rpm离心沉淀，弃去上清液，向每1g沉淀中加入含有质量体积比浓度为0.24％的TritonX-100磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0)10-15mL，于4℃下缓慢搅拌1h，随后10000-12000rpm离心，弃去沉淀，上清液即为酶液I。

(2)离子交换层析

将步骤(1)得到的酶液I上样于DEAE-Sephacel或DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析柱，然后用含有0-29.3g/L NaCl的磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0)洗脱，收集具有叶绿素酶活性的组分，加入超滤浓缩离心管中，3000rpm，4℃离心，得到的浓缩液即为酶液II。

(3)非变性凝胶电泳

将步骤(2)中得到的酶液II与上样缓冲液(20mmol/L、pH6.8的Tris-HCl；质量体积比为10％的甘氨酸；质量体积比为0.1％的十二烷基磺酸钠)混合加样于丙烯酰胺质量浓度为5-6％的浓缩胶及丙烯酰胺质量浓度为12-14％的分离胶上，电泳。电泳后将分离胶每0.5cm横向割成条带，分别放入磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0)中，37℃过夜浸出蛋白，收集有叶绿素酶活性的组分即为纯化的叶绿素酶液III。

上述酶的纯度可采用质量浓度为14％的丙烯酰胺，质量体积比为1％的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳缓冲液为25mmol/L Tris-甘氨酸(pH 8.3)，以考马斯亮蓝R-250染色，甲醇/冰醋酸/蒸馏水(1∶1∶8)脱色。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明依次采用有机溶剂沉淀、离子交换层析、非变性凝胶电泳方法纯化植物叶绿素酶，与现有的植物叶绿素酶纯化方法相比，纯化步骤少。将本发明纯化的酶液按所述检测方法检测，结果为单一条带，表明产物纯度高。

具体实施方式

实施例1

利用本发明的方法纯化银杏叶绿素酶，具体为：

(1)有机溶剂沉淀