[发明专利]猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法

权利要求书

1.一种猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其特征在于：

以生物反应器作为培养工具；以微载体作为细胞贴附的生长载体；以Marc-145细胞作为制苗用细胞；

并包括如下步骤：

(1)制苗用细胞的传代与培养

取长满单层的Marc-145细胞，经胰酶消化液消化传代，以细胞生长液培养，培养温度为35～38℃；形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体培养；

(2)细胞种毒的繁殖

用细胞维持液将猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒基础种毒按体积百分比0.5～5％的比例接种到步骤(1)形成的良好细胞单层继续培养，至细胞70～80％病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID₅₀和无菌检测，传至病毒TCID₅₀稳定且达到10^7.0TCID₅₀/mL以上时停止复壮，作为生产种毒；

(3)Marc-145细胞在生物反应器中的微载体培养

生物反应器按总体积的30％～80％加入无菌细胞生长液，启动生物反应器，低速搅拌30min后取步骤(1)生长良好的Marc-145细胞，经胰酶消化液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按1×10⁶个/mL～5×10⁶个/mL的密度接种到反应器中，设定适合的温度、pH、搅拌速度、溶氧含量的培养参数，进行反应器自动控制培养；

(4)制苗毒液的繁殖

待观察微载体上细胞长满80％～90％，空球率低于5％，满球率大于80％，细胞状态良好，且细胞计数结果达到3×10⁶个/mL～5×10⁶个/mL以上进行接毒操作，按0.5～5％比例介入步骤(2)制备好的猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒生产种毒，设定适合的温度、pH、搅拌速度、溶氧的培养参数，进行反应器自动控制培养；接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品的TCID₅₀；待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值明显上升至80％～100％，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液和微载体；

(5)收获病毒液的处理

病毒液和微载体经2～3次冻融后，离心或过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存即为病毒液。

2.根据权利要求1所述的猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其特征在于：采用的生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度，适用于微载体培养的生物反应器，容积为3L～3000L。

3.根据权利要求1所述的猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其特征在于：所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体在使用前需清洗、灭菌，方法如下：1)用PBS浸泡微载体三小时以上；2)用PBS清洗微载体3遍；3)用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟。

4.根据权利要求1所述的猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其特征在于：所述的胰酶消化液配方为：质量百分数为0.25％的胰酶；细胞生长液配方为：体积百分含量分别是90％～92％的DMEM液、8％～10％的牛血清、加入不超过500IU/ml的双抗，调整pH为6.8～7.6。

5.根据权利要求1所述的猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其特征在于：所述的种毒接种量为体积百分比0.5～5％，病毒培养时使用的细胞维持液配方为：含血清1～4％的DMEM液、加入不超过500IU/ml的双抗，pH调整为7.2～7.8；培养温度为33～38℃。

6.根据权利要求1所述的猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其特征在于：所述的生物反应器设定参数为：培养温度33～38℃、pH 7.20～7.80、溶氧30％～70％、搅拌转速30～50rpm。