[发明专利]能促进文山红柱兰组培苗生长的轮枝霉属真菌的分离与应用

说明书

技术领域：

本发明是关于从兰花根中分离到的菌根菌对文山红柱兰组培苗生长有促进作用，属于植物保护和生物技术领域。 

背景技术：

兰科(Orchidaceae)植物俗称兰花，全世界约有700属20000多种及大量变种，主要分布于热带、亚热带和温带地区，尤其南美洲和亚洲的热带地区为多。兰科植物根据生长环境的不同可分为地生兰、附生兰和腐生兰3类，作为一种重要的观赏花卉和药用植物资源，在花卉和天然药物产业上有着巨大的经济价值和利用潜能。随着中药现代化和兰花产业的快速发展，对兰科植物的需求迅速增长。但兰科植物种子细小，仅具未分化的原胚；根粗大，根毛不发达。在自然条件下种子不能正常萌发，根也不能满足植物体对水分和营养物质的需求，使兰科植物的人工栽培相当困难。近年来，组织快繁技术已应用于兰科植物，实现了兰科植物的工厂化育苗，但组培苗移栽成活率很低，生长缓慢，很难大面积推广，其主要原因在于兰花在短期内无法与相关的真菌形成菌根，菌根真菌对于兰科植物有着重要的意义。研究表明，自然状态下只有真菌与兰科植物种子或根形成共生的菌根关系后，兰科植物才能正常地萌发和生长发育。 

菌根是土壤中的一类真菌与植物根系之间所形成的互惠互利的共生联合体。1885年Frank提出了“菌根(Mycorrhiza)”这一术语来描述植物与真菌的共生联合体，由此菌根研究开始迅速发展。Link首先证实了兰科植物根中存在着真菌，之后，兰科植物与菌根关系得到证实，并进行了广泛研究。1903年Bernard首次报道了真菌和兰科植物种子萌发的关系。Burgeff对真菌和兰科种子研究得出，兰科种子在真菌的侵染下萌发，他分离并命名了许多真菌，发展 了消化真菌作为兰科植物生长营养来源的重要理论，之后国内外相继大量开展了兰科菌根真菌与兰科植物之间的关系的研究。 

我国兰科植物菌根菌研究发展很快，天麻菌根菌已经成功地应用于天麻种子萌发和人工栽培。但尚有很多兰科植物菌根菌需要研究，深入了解共生菌的种类及特点，探讨兰科植物与真菌间的相互作用机制，筛选优良的兰科植物共生真菌，研制兰科菌剂，对于实现兰科植物的工厂化生产具有重要的意义。 

发明内容：

本发明的主要目的是解决兰科组培苗移栽成活率低，筛选出有利于兰科植物生长的共生菌。 

本发明采用的真菌是轮枝霉属(Verticillium tenerum)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2010年06月17日；保藏登记入册的编号CGMCC No.3927。 

本发明的真菌菌株轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株，分离自兰花根内组织，经培养性状，形态学和分子鉴定，该菌株为轮枝霉属(Verticillium spp.)。该菌株具有以下特征：(1)该菌株在显微镜下可观察到分生孢子梗轮状分枝，产孢细胞基部略膨大；(2)该菌株能促进兰花组培苗的生长。 

本发明是这样实现的：分离兰花根内真菌，对分离到的真菌进行形态鉴定，并对其进行兰花组培苗的接种筛选有效共生真菌，对有效菌株进行ITS区段克隆测序。 

本发明轮枝霉属(Verticillium spp.)的分离鉴定方法： 

1、菌根菌的分离和纯化 

PDA固体培养基配方为：20％马铃薯，2％葡萄糖，2％琼脂粉。 

从兰花植株上取下健壮根段，冲洗干净，放入烧杯内待用。在进行好灭菌和消毒处理的超净工作台上，将烧杯内的根段用70％酒精消毒30s，再用0.1％升汞溶液浸泡1min，最后用无菌水清洗3-5遍。在无菌条件下，捣碎组织，倒入无菌水，在显微镜下用移液枪吸取菌丝团到PDA培养基中，24℃恒温黑暗培养，菌落长成后，重复取菌落边缘部分进行转接纯化。 

2、分离菌株的形态学鉴定 

将纯化后的菌株在25℃的恒温下培养5-7天，用镊子或解剖针在菌落边缘取少量菌丝放在载玻片上，用3％的KOH溶液和0.05％番红染液染色做成玻片，通过显微镜观察其形态特征，初步鉴定分离菌株所属。 

3、分离菌株的分子鉴定 

3.1DNA的提取