[发明专利]一种鉴别日本血吸虫的引物、相应的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于鉴别中国大陆山区型和湖沼型日本血吸虫的引物，其特征在于上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的用于鉴别中国大陆山区型和湖沼型日本血吸虫的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于包括如下组分：

（1）DNA裂解液：核裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液的混合溶液；

（2）PCR反应液：dATP、dTTP、dGTP、dCTP、上游引物、下游引物和MgCl₂的混合溶液；

（3）日本血吸虫山区型DNA对照和湖沼型DNA对照。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于包括如下组分：

（1） DNA裂解液，27.5mL：为100个反应的200μL核裂解液、50μl pH 8.0的0.5mol/L的EDTA、20μl 蛋白酶K和5μL RNase A溶液的混合溶液；

（2） PCR反应液，2.5mL：为终浓度200μmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，终浓度0.25pmol/μL的上游引物和下游引物，2mmol/L的MgCl₂的混合溶液；

（3）日本血吸虫山区型DNA对照100μL和湖沼型DNA对照100μL；

（5）Taq DNA聚合酶，5U/μL，25μL。

5.权利要求2~4所述试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）日本血吸虫DNA的提取；

（2）PCR扩增：按照扩增样品数取PCR反应液、Taq酶混合，混匀，分装；将阳、阴性对照液分别加入一个管中，取各样品的DNA加入对应反应管中；离心混匀，置于PCR扩增仪上反应；

（3）PCR产物观察：取扩增后的PCR产物加样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，90V电压电泳3h后置于胶片观察灯上观察结果并拍照分析。

6.根据权利要求5所述试剂盒的使用方法，其特征在于步骤（2）中所述PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec、56℃退火30sec、72℃延伸30sec，35个循环；72℃后延伸10min。

7.利用权利要求1所述引物鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（1）日本血吸虫DNA提取；

（2）用权利要求1所述特异性检测引物进行PCR扩增；

    （3）扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶检测，胶片观察灯上观察，条带与山区型DNA对照相一致的即为山区型日本血吸虫，条带与湖沼型日本血吸虫相一致的即为湖沼型日本血吸虫；

（4）PCR扩增条件为94℃预变性5 min；94℃变性30 sec、56℃退火30 sec、72℃延伸30 sec，35个循环；72℃后延伸10 min。

8.（5）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳为90V电压下电泳3h。